[发明专利]饲料中单增李斯特氏菌的微滴数字PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种单增李斯特氏菌的PCR扩增引物及探针引物，包括单增李斯特氏菌引物正向序列5＇‑CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT‑3＇，反向序列；5＇‑CGCGACCGAAGCCAACTA‑3＇；探针序列5＇‑FAM‑ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG‑TAMRA‑3＇；一种饲料中单增李斯特氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为110的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定单增李斯特氏菌的PCR扩增引物及探针引物；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对单增李斯特氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。

主权项

饲料中单增李斯特氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：1）称取25g单增李斯特氏菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；单增李斯特氏菌样品的增菌培养按照GB 4789.13进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20‑30h；获得样品及对照组的增菌液；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）获得鉴定单增李斯特氏菌的PCR扩增引物及探针引物；4）将步骤2）所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；所述的微滴数字PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×ddPCR 预混液10μL，上下游引物（10 µmol/L）各1μL，探针引物（10 µmol/L）1μL，模板DNA 4μL，双蒸水3μL；反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；体系完成后，进行数字PCR反应；5）对步骤4）的反应液进行检测与分析。