[发明专利]一种CIK细胞的制备方法

摘要

本发明涉及免疫细胞的体外培养，更具体涉及一种CIK细胞的体外诱导培养。本发明所述制备方法包括：纤连蛋白和CD3单抗包被细胞培养瓶；制备自体血浆；获取外周血单个核细胞PBMC；IL‑2、IFN‑γ和自体血浆诱导PBMC；扩增培养。本发明制备得到的CIK细胞，CIK细胞数量多、细胞活率高、CD3+CD56+效应细胞比例高、细胞毒活性强，均可达到临床要求，抗肿瘤能力强。

主权项

1. 一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：(1)准备阶段：① 配包被液：50mL离心管中加入D‑PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白250μL，终浓度12.5μg/mL，鼠源CD3单抗100μL，终浓度5μg/mL；② 包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；(2)外周血单核细胞诱导培养：① 采血：采集外周血50mL；② 制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；③ 分离淋巴细胞：将步骤(2)‑②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液，室温下800g离心20min；离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mL PBS清洗，1200 rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0 .5mL计数，1000 rpm离心6min，弃上清；④ 配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mL GT‑T551培养基重悬，混匀；⑤ 清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)‑②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mL PBS洗一次，然后再用20mL GT‑T551培养基洗一次；⑥ 接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mL GTT551培养基，添加终浓度为1000单位/mL的IL‑2和终浓度为1000单位/mL的IFN‑γ，以及终浓度为1％的上述制备的自体血浆；将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱，在37℃，5％CO2的条件中培养；(3)扩增培养：① 培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为200单位/mL的IL‑2、200单位/mL的IFN‑γ、50ng/mL的CD3单抗；② 培养14天后，收获细胞。