[发明专利]一种CIK细胞的制备方法

说明书

本发明涉及免疫细胞的体外培养，更具体涉及一种CIK细胞的体外诱导培养。本发明所述制备方法包括：纤连蛋白和CD3单抗包被细胞培养瓶；制备自体血浆；获取外周血单个核细胞PBMC；IL‑2、IFN‑γ和自体血浆诱导PBMC；扩增培养。本发明制备得到的CIK细胞，CIK细胞数量多、细胞活率高、CD3+CD56+效应细胞比例高、细胞毒活性强，均可达到临床要求，抗肿瘤能力强。

技术领域

本发明涉及免疫细胞的体外培养，更具体涉及一种CIK细胞的体外诱导培养。

背景技术

CIK(cytokine induced killer)细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一类以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，同时表达NK细胞(自然杀伤细胞)表面标志(CD56分子)和T细胞表面标志(CD3分子)，故又称为NKT细胞(自然杀伤T细胞)；兼具T细胞强大的抗瘤活性，以及NK细胞非MHC(主要组织相容性抗原)限制性杀瘤的特点。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，目前已成为临床上肿瘤过继免疫治疗的重要方案。

CD3+CD56+双阳性细胞在正常人体外周血组分中含量极少，体外在含多种细胞因子的培养基中扩增，可使CD3+CD56+双阳性细胞数量成百倍扩增。

细胞因子是一类由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长分化、调节免疫功能和生理活性并参与病理反应的小分子蛋白质。在CIK细胞的诱导中，常用的细胞因子种类有：

白细胞介素(Interleukin，IL)：介导白细胞间相互作用的细胞因子。

IL-1：又叫淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，可与IL-2或干扰素协同作用增强NK细胞活性，有IL-1α和IL-1β两种存在形式。

IL-2：又称T细胞生长因子，主要由T细胞产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。能够活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。

IL-21：与IL-2、IL-4、IL-15空间结构同源，促进骨髓NK细胞的增殖与分化，与抗CD40抗体协同刺激B细胞的增殖，与抗CD3抗体协同刺激T细胞的增殖。

IL-15：分子结构与IL-2相似，可利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性，可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ(γ干扰素)。

IL-12：主要由B细胞和巨噬细胞产生，主要作用于T细胞和NK细胞，可刺激活化型T细胞增殖，诱导CIK细胞的细胞毒活性。

干扰素(Interferon，IFN)：抵抗病毒感染，干扰病毒复制的细胞因子，包括：IFN-α、IFN-β(I型)；IFN-γ(II型)。CIK细胞诱导中常用IFN-γ。

目前CIK细胞的制备方法是将分离得到的外周血单个核细胞用IFN-γ刺激24小时后，再用CD3单抗、IL-1α、IL-2等因子进行刺激。但是诱导产生的CIK细胞细胞活力和肿瘤杀伤能力低，对肿瘤的治疗效果十分有限。此外，还有少数供血者的单个核细胞对CD3单抗和一些细胞因子的诱导不敏感，细胞增殖速度缓慢，因此本领域技术人员仍致力于开发一种诱导产生的CIK细胞数量多、细胞毒活性强的CIK细胞制备技术。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种制备得到的CIK细胞数量多、活率高、CD3+CD56+效应细胞比例高、细胞毒活性强的CIK细胞的制备方法。

本发明提供一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：