[发明专利]一种蛇胆汁的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种蛇胆汁的鉴别方法，该方法通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分，快速有效地鉴别出蛇胆汁的真伪。本发明的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。

主权项

1.一种蛇胆汁的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）样品制备：活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；（2）模板DNA提取：1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再以12000转/分钟离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，以12000转/分钟离心2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，以12000转/分钟离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液；置-20℃保存备用；（3）PCR反应：1）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为 20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，浓度为2.5mmol/L 的dNTP 0.6µL，浓度为10µmol/L鉴别引物各0.5µL，浓度为5U/µL的高保真Taq DNA聚合酶0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，将反应95℃30秒、58℃30秒和72℃30秒连续循环35次，72℃延伸7分钟；（4）电泳检测：1）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL，浓度为0.5µg/µL；2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。