[发明专利]一种蛇胆汁的鉴别方法

说明书

本发明公开了一种蛇胆汁的鉴别方法，该方法通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分，快速有效地鉴别出蛇胆汁的真伪。本发明的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，具体是一种蛇胆汁的鉴别方法。

背景技术

蛇胆首载于《名医别录》，为蚺蛇胆和蝮蛇胆，《本草纲目》列于鳞部第四十三卷鳞之二蛇类项下，并增收了乌蛇胆和鳞蛇胆。《中国药典》20L5年版四部收载蛇胆汁为眼镜蛇科、游蛇科或蝰科动物多种蛇的胆汁，但目前药用来源的蛇胆远远超出以上范围。由于蛇胆具有独特的药用价值，加上市场需求量大，自然资源递减，市场上含蛇胆的中药制剂较多，常见的有蛇胆川贝散、蛇胆川贝液、蛇胆追风丸、蛇胆川贝枇杷膏等。市场上蛇胆的伪品时有发现，报道的掺假物有鸡、鸭、鱼、猪、牛等动物胆汁和淀粉糊、青菜汁、明胶液、色素以及熟地黄提取液等 ，以及油胆(用机油刺激蛇鼻腔或蛇体，使胆汁增多而质差)或蜜胆或将蛇胆多次浸泡，再把蛇胆与酒液分别销售使胆汁稀薄质差。多年来，国内外研究者一直致力于运用各种分析方法进行蛇胆的质量控制研究。

发明内容

本发明的目的是提供了一种蛇胆汁的鉴别方法，拟建立一种通过PCR方法鉴别出蛇胆汁及其他掺假动物胆汁的检验方法，以达到快速有效的鉴别出蛇胆汁的真伪，在药用上能正确地鉴别蛇胆汁，从源头上控制药品质量和保障用药安全。

本发明所述蛇胆汁的鉴别方法包括以下步骤：

（1）活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；

（2）模板DNA提取：

1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。

2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液，置-20℃保存备用。

（3）PCR反应：

L）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；