[发明专利]一种致病性沙门氏菌测试条的制备方法

摘要

本发明涉及致病性沙门氏菌测试条的制备方法，可有效解决现有检测方法费时、繁琐的问题，技术方案是，包括基材PVC、玻璃纤维和硝酸纤维膜，基材PVC板上固定有第一覆膜、引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，硝酸纤维膜上包被有检测区和质控区，引水玻璃纤维和载体玻璃纤维上覆盖有第二覆膜，吸水棉浆板上覆盖有第三覆膜；制备方法制备纯化的单克隆抗体、制备胶体金颗粒、制备标记物、包被纤维膜、组装测试条；测试条采用胶体金免疫层析检测法，将免疫反应的特异性、层析方法的快速性、以及胶体金颗粒作为示踪物的直观性等诸多优点结合在一起，实现对致病性沙门氏菌简便、特异、灵敏的快速检测，稳定可靠。

主权项

一种致病性沙门氏菌测试条，包括基材PVC板、玻璃纤维和硝酸纤维膜，其特征在于，基材PVC板1上依次固定有第一覆膜7、引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆板5，所述的硝酸纤维膜2上包被有检测区8和质控区9，所述的引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第二覆膜10，所述的吸水棉浆板5上覆盖有第三覆膜6，其制备方法包括以下步骤：（1）制备纯化的单克隆抗体：取体积计的1份小鼠腹水和3份pH4.4浓度60mM的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水滴加100‑140μl正辛酸，混匀，18‑22℃室温放置30‑60分钟，4℃下10000‑15000转/分钟离心20‑30分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2‑7.4，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中0.277‑0.377g，18‑22℃放置20‑30分钟，4℃下8000‑12000转/分离心10‑20分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH 7.4的PBS溶液溶解，装入透析袋，对pH 7.4的PBS缓冲液4℃透析36‑48小时，每4‑6小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；所述的小鼠腹水是指将液体石蜡注射于BALb/c小鼠腹腔内，注射量为0.3‑0.5ml/只小鼠， 1‑3周后，分别将分泌抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只小鼠，小鼠出现腹水后用无菌注射器采集腹水，即为抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体的小鼠腹水；按照上述方法分别制备纯化的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体；（2）制备胶体金颗粒：采用柠檬酸三钠还原法，将1000ml蒸馏水，100℃煮沸4‑6分钟，再加入质量浓度1%的氯金酸溶液1ml和质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液1.5‑2.5ml，搅拌至溶液呈深红色，冷却至室温，得胶体金颗粒溶液；（3）制备标记物：取3份步骤（2）制备的胶体金颗粒溶液，各100ml，按照2‑4µg /ml胶体金分别加入步骤（1）制备的纯化的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，搅拌2分钟后用质量浓度10%的牛血清白蛋白终止反应，10000‑15000转/分钟下离心20‑30分钟，沉淀用浓度0.01M、 pH7.4的PBS稀释至原体积的10%，分别得胶体金标记的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，再按照体积比1：1：1的比例混合得混合液，用玻璃纤维吸附混合液，得标记物；（4）包被纤维膜： 取步骤（1）制备的纯化抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，按蛋白含量1：1：1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区8；抗鼠免疫球蛋白抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区9；检测区8和质控区9的包被划线相距5mm，抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为1 ~5mg/ml，抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3特异性单克隆抗体的包被浓度为0. 5~2mg/ml；（5）组装测试条：取基材PVC板1，将第一覆膜7、引水玻璃纤维3、含步骤（3）制备的标记物的载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2，吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，所述的硝酸纤维膜2上包被有抗鼠免疫球蛋白抗体的质控区9和抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3特异性单克隆抗体的检测区8，检测区8和质控区9暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第二覆膜10，吸水棉浆板5上覆盖有第三覆膜6，切割成长条即得致病性沙门氏菌测试条。