[发明专利]一种致病性沙门氏菌测试条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种致病性沙门氏菌测试条的制备方法。

背景技术

沙门氏菌广泛分布于自然界，在人和动物中有广泛的宿主，沙门氏菌是引起食物中毒最常见的病原菌，在我国细菌性食物中毒爆发起数和发病人数多年来排第一位，在引起沙门氏菌中毒的食品中，绝大多数是肉类等动物性食品，其次为蛋、奶及其制品。沙门氏菌食物中毒主要症状有寒战、头痛、头晕、恶心与痉挛性腹痛，继之出现呕吐、腹泻、全身酸痛或发热。每天腹泻可达7～8次。严重者，特别是儿童，老年人和体弱者常因脱水、酸中毒、无尿、心力衰竭等，救治不及时而危及生命。

沙门氏菌属型别繁多，抗原复杂，从人和动物中分离出67个菌群、2000多个血清型和变种，对人致病的主要是A、B、C、D、E群，每群包含数个菌种，其中A、B、D群沙门氏菌含有共同的菌体抗原Ｏ12，C群沙门氏菌含有共同的菌体抗原Ｏ6，E群沙门氏菌含有共同菌体抗原Ｏ3。目前对沙门氏菌的检验普遍采用分离培养法，报告检测结果大致需要4-7天，程序繁琐，耗时太长，所以，建立快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题，提高沙门氏菌检测的灵敏度和特异性、缩短检测时间、简化检测程序，是沙门氏菌检测的发展趋势。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种致病性沙门氏菌测试条的制备方法，可有效解决现有沙门氏菌检测方法费时、繁琐的问题。

本发明解决的技术方案是，一种致病性沙门氏菌测试条，包括基材PVC、玻璃纤维和硝酸纤维膜，基材PVC板（1）上依次固定有第一覆膜（7）、引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）和吸水棉浆板（5），所述的硝酸纤维膜（2）上包被有检测区（8）和质控区（9），所述的引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第二覆膜（10），所述的吸水棉浆板（5）上覆盖有第三覆膜（6），其制备方法包括以下步骤：

（1）制备纯化的单克隆抗体：

取体积计的1份小鼠腹水和3份pH4.4浓度60mM的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水滴加100-140μl正辛酸，混匀，18-22℃室温放置30-60分钟，4℃下10000-15000转/分钟离心20-30分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2-7.4，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中0.277-0.377g，18-22℃放置20-30分钟，4℃下8000-12000转/分离心10-20分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH 7.4的PBS溶液溶解，装入透析袋，对pH 7.4的PBS缓冲液4℃透析36-48小时，每4-6小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；所述的小鼠腹水是指将液体石蜡注射于BALb/c小鼠腹腔内，注射量为0.3-0.5ml/只小鼠， 1-3周后，分别将分泌抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×10⁶/只小鼠，小鼠出现腹水后用无菌注射器采集腹水，即为抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体的小鼠腹水；按照上述方法分别制备纯化的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体；

（2）制备胶体金颗粒：

采用柠檬酸三钠还原法，将1000ml蒸馏水，100℃煮沸4-6分钟，再加入质量浓度1%的氯金酸溶液1ml和质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液1.5-2.5ml，搅拌至溶液呈深红色，冷却至室温，得胶体金颗粒溶液；

（3）制备标记物：

取3份步骤（2）制备的胶体金颗粒溶液，各100ml，按照2-4µg /ml胶体金分别加入步骤（1）制备的纯化的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，搅拌2分钟后用质量浓度10%的牛血清白蛋白终止反应，10000-15000转/分钟下离心20-30分钟，沉淀用浓度0.01M、 pH7.4的PBS稀释至原体积的10%，分别得胶体金标记的抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，再按照体积比1：1：1的比例混合得混合液，用玻璃纤维吸附混合液，得标记物；

（4）包被纤维膜：

取步骤（1）制备的纯化抗Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3单克隆抗体，按蛋白含量1：1：1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区（8）；抗鼠免疫球蛋白抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区（9）；检测区（8）和质控区（9）的包被划线相距5mm，抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为1 ~5mg/ml，抗沙门氏菌菌体抗原Ｏ12、Ｏ6、Ｏ3特异性单克隆抗体的包被浓度为0. 5~2mg/ml；

（5）组装测试条：