[发明专利]一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法

摘要

本发明公开了一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，该工艺采用补料分批发酵，过程包括：细胞快繁阶段：将菌种接种至基础发酵培养基；温度为30～37℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.2～0.5；产酶阶段：细胞浓度达到OD600＝70～90时，加入乳糖诱导工程菌产酶，直至发酵结束；培养温度为15～25℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.01～0.1。本发明工艺将补料分批发酵人为分成两个阶段并控制各阶段的培养条件，使得重组腈水合酶基因工程菌实现高密度发酵，不仅提高了产腈水合酶的工程菌的菌浓度，还提高了腈水合酶的酶活。

主权项

1.一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，表达所述重组腈水合酶的基因工程菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)；所述补料分批发酵的过程包括：（1）细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为32~35℃，发酵液的溶氧量为20~30%，发酵液的pH值为6.8~7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2~0.5之间；以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5~15%；发酵培养的时间为8~16 h；（2）产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600=70~90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为18~20℃，发酵液的溶氧量为30~50%，发酵液的pH值为6.8~7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01~0.1之间；以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量为5~15g/L ；发酵培养的时间为48~96 h；所述基础发酵培养基为：20 g/L甘油，8 g/L蛋白胨，12 g/L酵母抽提物，17.1 g/L Na2HPO4·12 H2O，3.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl和0.6 g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50 µg/mL；所述补料培养基为：300~600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物。