[发明专利]一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法

摘要

本发明公开了一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法。本发明通过优选三倍体卵子、精选二倍体精子、抑制受精卵第二极体、获得四倍体幼虫、培育四倍体子代等技术环节，利用了部分三倍体卵子可以行使正常减数分裂的特性，创造了一种抑制受精卵(三倍卵子+二倍体精子)第二极体制备四倍体的育种方法。本发明不同于通过抑制受精卵第一极体获取四倍体的方法，颠覆了传统制种模式，打破了美国、法国、韩国等国外势力对牡蛎四倍体培育技术的垄断，首次获得了可存活的香港牡蛎幼贝，为今后采用生物学方法生产100％香港牡蛎三倍体提供了可行性，也为华南沿海香港牡蛎产业稳步发展，产业良种化提供了可能。本发明具有可实施、可重复、可应用等优点。

主权项

1.一种香港牡蛎四倍体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、优选三倍体卵子：在香港牡蛎繁殖季节，利用流式细胞仪检测香港牡蛎三倍体个体，选择3N个体，之后解剖三倍体，挑选性腺部分，进行显微镜镜检性别，筛选到雌性个体，选择卵子发育整齐、卵黄颜色较深、卵量≥1000万个的个体作为雌性亲本，剔除掉卵子数量少、性腺未发育及个别雄性个体；将雌性亲本的卵子挤出来，利用200目筛绢网过滤，放置于盐度15‑20ppt海水中激活30‑60min，之后用400目筛绢网洗卵，重复2‑3次，去除杂质，待卵子完全变圆，再用流式细胞检测卵子倍性为6N的方可使用；b、精选二倍体精子：解剖常规香港牡蛎二倍体，取部分性腺，显微镜镜检性别，选择性腺饱满、精子活力强的个体作为雄性亲本，剔除掉精子活力差或者无活力个体；待步骤a中三倍体卵子数量的90％以上变圆时，解剖雄性亲本的精子放入15‑20ppt海水中激活10‑15min，显微镜下精子≥90％活蹦乱跳，利用流式细胞仪检测精子倍性为1N的方可使用；c、抑制受精卵第二极体：单体精子加入单体三倍体卵中，控制每个卵子周围有6‑9个精子，受精卵密度控制在≤3万个/ml，形成受精卵；在此期间，温度控制在28‑30℃，盐度控制在15‑20ppt；之后，用显微镜观察受精卵第一二极体释放时间，当第一极体的数量占比出现50％时候，利用细胞松弛素B开始抑制受精卵，直至发现有数量的10％未处理的受精卵进入二细胞期时，药物处理结束，洗去卵液中的细胞松弛素，放置于水泥池中孵化；d、获得四倍体幼虫：经过孵化，获得多倍体D形幼虫；e、培育四倍体子代：采用常规方法培育四倍体幼虫，获得四倍体幼贝。