[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法

摘要

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞裂解、标准品配制、样品配制、吸光度测定、蛋白浓度测定和过氧化氢酶酶活力计算等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟制品对过氧化氢酶酶活力的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤。

主权项

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种：将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；表1细胞过氧化氢酶活性检测加样表(6)收集细胞：移除细胞培养皿中的培养基，培养皿中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；(7)细胞裂解在每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；(8)标准溶液配制：分别取0、12.5、25、50、75μL的5mM过氧化氢标准品溶液，置于不同的1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液定容至100μL并混匀；(9)样品配制：按照表2配制各样品检测液，迅速混匀，25℃反应5min；再分别加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；取新的离心管加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀；表2测试体系配制表(10)吸光度测定：标准曲线组分别取步骤(8)中配制好的标准溶液，每个离心管中各取4μL加入96孔板；空白对照组和样品检测组分别取步骤(9)中配制好的检测液10μL加入96孔板；标准曲线组、空白对照组、样品检测组均加入200μL配制好的显色工作液，25℃孵育15min后酶标仪测定520nm处吸光度；(11)蛋白浓度测定：测定步骤(7)待测上清液的蛋白浓度；(12)过氧化氢酶酶活力计算：a.根据步骤(10)所得标准溶液吸光度值绘制标准曲线，A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；b.计算样品中残余的过氧化氢微摩尔数：残余过氧化氢微摩尔数＝(A520‑b)/k；c.过氧化氢酶酶活力计算：[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μl×[蛋白浓度])。