[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法

权利要求书

1.一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1细胞过氧化氢酶活性检测加样表

(6)收集细胞：

移除细胞培养皿中的培养基，培养皿中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；

(7)细胞裂解

在每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；

(8)标准溶液配制：分别取0、12.5、25、50、75μL的5mM过氧化氢标准品溶液，置于不同的1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液定容至100μL并混匀；

(9)样品配制：按照表2配制各样品检测液，迅速混匀，25℃反应5min；再分别加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；取新的离心管加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀；

表2测试体系配制表

(10)吸光度测定：标准曲线组分别取步骤(8)中配制好的标准溶液，每个离心管中各取4μL加入96孔板；空白对照组和样品检测组分别取步骤(9)中配制好的检测液10μL加入96孔板；标准曲线组、空白对照组、样品检测组均加入200μL配制好的显色工作液，25℃孵育15min后酶标仪测定520nm处吸光度；

(11)蛋白浓度测定：测定步骤(7)待测上清液的蛋白浓度；

(12)过氧化氢酶酶活力计算：

a.根据步骤(10)所得标准溶液吸光度值绘制标准曲线，A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；

b.计算样品中残余的过氧化氢微摩尔数：残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k；

c.过氧化氢酶酶活力计算：[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μl×[蛋白浓度])。