[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法

摘要

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、装载探针、样品测定和活性氧水平计算等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟制品对细胞活性氧分泌量的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤。

主权项

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露取出细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液和培养基加入细胞培养板中作为检测样品组，每个检测剂量设4孔平行，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；同时设置阳性对照组，阳性对照物原液为25mg/mL的Rosup溶液；表1细胞活性氧分泌检测加样表(6)装载探针：暴露培养完成后移除细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/L的2',7'‑二氯荧光黄双乙酸盐DCFH‑DA荧光探针100μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育20min；(7)样品测定：移除细胞培养板中的液体，每孔中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的DCFH‑DA探针，然后在1h～6h内用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；(8)活性氧水平计算：根据所得光度值，按照下列公式计算样品的活性氧水平，以相对荧光强度表征；如刺激后OD值升高则计算活性氧升高率：活性氧升高率＝(刺激后OD值‑刺激前OD值)/刺激前OD值×100％；如刺激后OD值降低则计算活性氧降低率：活性氧降低率＝(刺激前OD值‑刺激后OD值)/刺激前OD值×100％。