[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法

权利要求书

1.一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液和培养基加入细胞培养板中作为检测样品组，每个检测剂量设4孔平行，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；同时设置阳性对照组，阳性对照物原液为25mg/mL的Rosup溶液；

表1细胞活性氧分泌检测加样表

(6)装载探针：暴露培养完成后移除细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/L的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐DCFH-DA荧光探针100μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育20min；

(7)样品测定：移除细胞培养板中的液体，每孔中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA探针，然后在1h～6h内用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；

(8)活性氧水平计算：根据所得光度值，按照下列公式计算样品的活性氧水平，以相对荧光强度表征；

如刺激后OD值升高则计算活性氧升高率：活性氧升高率＝(刺激后OD值-刺激前OD值)/刺激前OD值×100％；

如刺激后OD值降低则计算活性氧降低率：活性氧降低率＝(刺激前OD值-刺激后OD值)/刺激前OD值×100％。