[发明专利]一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法

摘要

本发明公开了一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、加样和受试物分组、孵育受试物、收获细胞、低渗、滴片、染色、微核观察、结果判定等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物对细胞微核率的影响程度，进而确定电子烟制品的遗传毒性。

主权项

一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种：将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)加样，受试物分组：移除6孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为4组非零剂量，分别为：12.5％待测液、25％待测液、50％待测液和100％待测液；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均加入1mg/mL的细胞松弛素B溶液6μl；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至2mL/孔；(6)孵育受试物：将加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h；(7)收获细胞：加入浓度0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来；(8)低渗：将消化后收获的细胞置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；(9)滴片：取出离心管并移除上清液，加入300μl甲醇冰醋酸溶液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每个检测剂量滴3张玻片；(10)染色：将晾干后的玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，用水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；(11)微核的观察：取染色后所得微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；(12)结果判定：将检测样品组与细胞对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。