[发明专利]一种灵敏探针及制备方法和利用其检测肠炎沙门氏菌的方法

摘要

一种灵敏探针及制备方法和利用其检测肠炎沙门氏菌的方法，它涉及一种探针及制备方法和探针的应用。本发明的目的是要解决现有探针昂贵、不稳定，抗体容易失活和灵敏度差的问题。一种灵敏探针由抗生素和信号载体制备而成，其制备方法为：一、制备黄棕色乳状液；二、制备羧基化的免疫磁珠；三、制备活化的磁性微球；四、加入重悬液保存；利用灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的方法：一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；二、待测液体与灵敏探针混合孵育，再逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，反应10分钟，读取结果。本发明只有一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，大大节省了成本，简单，方便。本发明适用于检测肠炎沙门氏菌。

主权项

1.利用一种灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的非诊断方法，其特征在于利用灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的非诊断方法具体是按以下步骤完成的：一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条：肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有肠炎沙门氏菌单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；所述的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的制备方法如下：①、检测线的制备：将肠炎沙门氏菌单克隆抗体溶于包被液中，得到肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液；用划线方式将肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿25mm～30mm的位置上，得到检测线，然后于36℃～37℃条件下干燥20min～30min，得到含有检测线的硝酸纤维素膜；②、样品垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长为13mm～18mm，宽为2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到样品垫；③、结合垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长为7mm～9mm，宽2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到结合垫；④、吸水垫的制备：将吸水纸剪裁成长为16mm～20mm，宽为2mm～4mm，得到吸水垫；⑤、组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、含有检测线的硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，得到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；二、取100μL待检测液体，向100μL待检测液体中加入5μL灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后在温度为35～37℃和转速为200r/min～300r/min的摇床中充分混合孵育20min～40min，再进行磁分离，弃去上清液，得到磁和待检测物质的复合物；向磁和待检测物质的复合物中加入100μL蒸馏水或100μL0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行重悬，得到样品溶液；将样品溶液逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为检测试纸条，同时取100μL蒸馏水或100μL0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，逐滴滴加到另一肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为对照试纸条，10min后读取结果；检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌的浓度高于或等于80CFU/mL；(2)：阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌低于80CFU/mL；步骤二中所述的灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液的制备方法如下：使用pH值为6.6的硼酸缓冲液对灵敏探针清洗3次～5次，再加入重悬液，得到灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液；所述的灵敏探针的制备方法具体是按以下步骤完成的：(1)、将FeCl₃·6H₂O和二水合柠檬酸三钠加入到乙二醇中，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，再加入醋酸钠，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，得到黄棕色乳状液；步骤(1)中所述的FeCl₃·6H₂O的质量与乙二醇的体积比为(0.5g～1g):(10mL～30mL)；步骤(1)中所述的FeCl₃·6H₂O与二水合柠檬酸三钠的质量比为(0.5～1):(0.1～0.4)；步骤(1)中所述的FeCl₃·6H₂O与醋酸钠的质量比为(0.5～1):(1～2)；(2)、将步骤(1)中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为190℃～210℃的烘箱中放置8h～12h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗3次～5次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗3次～5次，最后在温度为60℃～70℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠；步骤(2)中所述的羧基化的免疫磁珠的粒径为150nm～200nm；(3)、将羧基化的免疫磁珠加入到蒸馏水中，再加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应20min～30min，再进行磁分离，弃除溶剂，得到反应物Ⅰ；使用蒸馏水清洗反应物Ⅰ3次～5次，得到活化的磁性微球；步骤(3)中所述的羧基化的免疫磁珠的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；步骤(3)中所述的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；步骤(3)中所述的N‑羟基琥珀酰亚胺的质量与蒸馏水的体积比为(0.5mg～1mg):1mL；(4)、①、将活化的磁性微球加入到pH值为6.6的硼酸缓冲液中，再加入氨苄青霉素，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到反应物Ⅱ；②、向反应物Ⅱ中加入含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液中，继续在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到灵敏探针；步骤(4)①中所述的活化的磁性微球的质量与pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)；步骤(4)①中所述的活化的磁性微球与氨苄青霉素的质量比为1:(2～5)；步骤(4)②中所述的反应物Ⅱ的质量与含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)。