[发明专利]一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及考古检测领域，公开了一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，采用FeCl2和亚氨基二琥珀酸四钠混合溶液体系提取柞蚕丝素蛋白，然后将柞蚕丝素蛋白作为完全抗原注射到兔体内，选出免疫效价高的兔，将其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的杂交瘤细胞经培养后用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的菌株，用有限稀释法克隆至有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%为止，用筛选出的细胞进行大转生产，然后利用层析柱对所得单抗进行纯化。本发明方法制备的抗体具有很强的特异性，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。

主权项

一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A）称取柞蚕丝并将其以1:23‑27的浴比添加至去离子水中，用盐酸调节pH至2.5‑3.0，于98‑102℃水浴中恒温加热55‑65min进行脱胶，然后加入NaHCO3调节pH至中性，按上述方法至少重复脱胶一次；将脱胶后的柞蚕丝加入至去离子水中浸泡1.5‑2.5h，然后在55‑65℃下烘干，制得柞蚕丝素蛋白样品；B）称取9‑11 g FeCl2，加入48‑52mL去离子水溶解后再滴加14‑16 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL，得到混合溶液；C）将步骤A）所得柞蚕丝素蛋白样品按固液比0.9‑1.1g/15mL加入到步骤B）所得混合溶液中，在55‑65℃水浴中搅拌保温55‑65min，取出待冷却后，将溶液置于45‑55kHz的超声波下处理25‑35min，同时用乙酸缓慢调节pH为8.5‑9.0；然后将溶液装入透析袋中进行透析，每2.5‑3.5h换一次水值至袋内溶液pH小于7，将袋内溶液冷冻干燥后得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨粉后制得柞蚕丝素蛋白完全抗原，备用；D）用生理盐水溶解步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1‑2 mg/mL，然后与QuickAntibody‑Rabbit8W按体积比0.9‑1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只的大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射；在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备；E）用0.4‑0.6 mg步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000‑14000 rpm下离心4‑6 min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；F）取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8‑2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000‑14000 rpm下离心4‑6 min，弃上清液，在35‑39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇‑1500，再加入1640培养液稀释，在10000‑14000 rpm下离心，弃上清液后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮；G）步骤F）所得细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%，利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段；H）pH 7.4的PBS溶液的制备；I）对步骤G）所得兔单克隆抗体进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为58‑62 mL/h；用30mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液清洗柱子，清洗的流速为115‑125 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在1‑5℃下储存备用。