[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法与应用，包括：S1：合成CAR序列；S2：将其整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；S3：将目的质粒与293T细胞混合并进行培养，收集病毒液，浓缩，得目的质粒的病毒浓缩液；S4：收集自体血浆以及外周血单个核细胞PBMC，用活化培养基调整细胞密度并进行细胞培养；转移到新的细胞培养袋中继续培养，并补充增殖培养基；培养完毕后得到NK细胞；S5：在NK细胞中加入目的质粒的病毒浓缩液进行孵育，得到CAR‑NK细胞。本发明的CAR‑NK细胞具有非常强的因子分泌能力和抑瘤能力，且制备CAR‑NK细胞的转染方法高效、稳定。

主权项

1.一种CAR‑NK细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；S1：以FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4‑1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR，并人工合成CAR序列CD19scFv‑‑CD28‑‑4‑1BB‑‑FcεRIγ；S2：将步骤S1中所合成的CAR序列CD19scFv‑‑CD28‑‑4‑1BB‑‑FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；S3：取对数生长期的细胞接种于细胞培养皿中；将步骤S2中所得到的目的质粒连同包装质粒和包膜质粒一同加入所述细胞中包装出病毒，最后收集病毒液，浓缩，检测浓缩病毒的滴度，即得目的质粒的病毒浓缩液；S4：①取外周血进行离心，收集分离液上层的自体血浆并进行灭活，并收集吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，洗涤，将自体血浆与单个核细胞PBMC混合，并用活化培养基调整细胞密度为(1～3)×106个/ml，然后进行细胞培养8～12天；②将①中整个细胞培养体系一起转移到新的细胞培养袋中继续培养4～10天，并在后续培养过程中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1～2)×107个/ml；③培养完毕后，检测NK细胞表型，CD3‑CD16+CD56+细胞比例达88％，无需分选，直接用于CAR‑NK的制备；S5：取步骤S4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的质粒的病毒浓缩液，加入改良型的多肽，使其终浓度为20～70ng/μL；然后在37℃孵育4‑6h后，收集细胞，600～1000g/min离心4～7min，弃病毒液，PBS洗涤，1640培养基重悬细胞，得到CAR‑NK细胞；所述改良型的多肽的序列为：Ac‑KKKNWFDWTNWLWYWK‑NH2。