[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法与应用，包括：S1：合成CAR序列；S2：将其整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；S3：将目的质粒与293T细胞混合并进行培养，收集病毒液，浓缩，得目的质粒的病毒浓缩液；S4：收集自体血浆以及外周血单个核细胞PBMC，用活化培养基调整细胞密度并进行细胞培养；转移到新的细胞培养袋中继续培养，并补充增殖培养基；培养完毕后得到NK细胞；S5：在NK细胞中加入目的质粒的病毒浓缩液进行孵育，得到CAR‑NK细胞。本发明的CAR‑NK细胞具有非常强的因子分泌能力和抑瘤能力，且制备CAR‑NK细胞的转染方法高效、稳定。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用。

背景技术

自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK细胞)是一种机体内重要的天然免疫系统淋巴细胞。其表型一般为CD3-CD16+CD56+，主要来源于骨髓CD34+淋巴细胞。NK细胞不受MHC的限制，无需抗原致敏即可以识别并且杀伤肿瘤细胞。同时，NK细胞可以分泌多种细胞因子来调节获得性免疫应答，是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的桥梁，所以NK细胞在抗肿瘤和抗病毒感染的免疫应答中起重要作用，被称为人类健康的第一道防线。

NK细胞对肿瘤细胞的识别主要依赖于细胞表面的受体，而不受MHC限制。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶使肿瘤细胞凋亡。除此之外，NK细胞还可以通过TNF凋亡信号通路和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是，由于肿瘤逃逸机制的存在，以及患者体内NK细胞数量、质量的下降等原因，NK细胞在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。

近年来，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAT-T)在血液肿瘤研究中取得了重大的技术突破，为人类攻克癌症带来了新的希望。但是，CAR-T疗法也存在着一些目前难以克服的问题，比如对实体瘤疗效不显著、细胞因子风暴、脱靶效应、插入突变等。因此，研发新型的具有强大抗肿瘤效应的细胞具有极其重要的理论和应用价值。NK细胞因其特殊的靶细胞识别机制、广谱抗瘤能力等优势，被视为有潜力通过CAR修饰来增强其抗肿瘤效应的细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力。

CAR修饰NK细胞的目的是通过基因编辑技术来建立一条活化NK细胞的激活通路并增强其靶向抗肿瘤效应。CAR-NK的基本结构框架和转染方式均源于CAR-T。CAR的主要结构同样包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区，这三部分构成的基本结构框架决定了CAR-NK的特异性和功能性。胞外抗原结合区主要由单链可变区片段(Single-chainvariable fragment，scFv)组成，能够识别肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原并与其结合，是决定CAR-NK细胞靶向性的关键所在。目前，应用于CAR-T的scFv均可直接应用于CAR-NK，如CD19、Her2、CD20等。跨膜区是将膜外信号传导到细胞内，与CAR-T类似，常用的跨膜区为CD3ζ和CD8的跨膜序列。胞内信号区含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，其组成为D/ExxYxxL/I，是CAR-NK和CAR-T细胞活化信号强弱的关键。当胞外抗原识别区与肿瘤相关抗原相互作用时，ITAM被铬氨酸激酶磷酸化而传递胞外的活化信号。在CAR-T细胞中，CD3ζ胞内信号段是最经典，也是最常用的胞内信号段。目前，CAR-NK中所用到的CAR的结构模式基本沿用的是CAR-T的设计，包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区，未能充分发挥NK细胞的特点。因此，根据NK细胞的特点，有针对性的设计CAR就显得尤为必要。

另一方面，CAR-NK除了基本结构继承了CAR-T外，其转染方式也与CAR-T一致。事实上，NK细胞比T细胞更难以转染。脂质体转染和电穿孔转染的转导效率均不足10％，慢病毒转染的效率为12％～73％，并不稳定。事实上，目前有研究报道一些细胞因子和多肽可以促进慢病毒对NK细胞的转染效率，如IL-15等。