[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；

S1：以FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4-1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR，并人工合成CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ；

S2：将步骤S1中所合成的CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；

S3：取对数生长期的细胞接种于细胞培养皿中；将步骤S2中所得到的目的质粒连同包装质粒和包膜质粒一同加入所述细胞中包装出病毒，最后收集病毒液，浓缩，检测浓缩病毒的滴度，即得目的质粒的病毒浓缩液；

S4：①取外周血进行离心，收集分离液上层的自体血浆并进行灭活，并收集吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，洗涤，将自体血浆与单个核细胞PBMC混合，并用活化培养基调整细胞密度为(1～3)×10⁶个/ml，然后进行细胞培养8～12天；②将①中整个细胞培养体系一起转移到新的细胞培养袋中继续培养4～10天，并在后续培养过程中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1～2)×10⁷个/ml；③培养完毕后，检测NK细胞表型，CD3-CD16+CD56+细胞比例达88％，无需分选，直接用于CAR-NK的制备；

S5：取步骤S4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的质粒的病毒浓缩液，加入改良型的多肽，使其终浓度为20～70ng/μL；然后在37℃孵育4-6h后，收集细胞，600～1000g/min离心4～7min，弃病毒液，PBS洗涤，1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞；所述改良型的多肽的序列为：Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2；其中，步骤S2中，所述目的载体质粒为pWPXL-GFP，整合CAR序列后所得的目的质粒记为pWPXL-FcεRIγ。

2.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述细胞为293T细胞，该293T细胞的接种于细胞培养皿中的量为(4～6)x10⁶个；然后在步骤S2中所得到的目的质粒中加入CaCl₂，得混合液，并将该混合液加入293T细胞中，在培养箱中培养以使慢病毒包装。

3.根据权利要求2所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3中，慢病毒包装的具体方法为：

(1)取400～500μl ddH₂O加入无菌EP管中，并加入目的质粒8～12μg、包装质粒5～8μg和包膜质粒3～4μg；所述目的质粒为pWPXL-FcεRIγ；

(2)缓慢加入45～55μl CaCl₂，轻轻混匀，得混合液；然后将含有CaCl₂和质粒的混合液加入到2x HBS中，轻轻混匀，室温静置10～20min；

(3)取对数生长期293T细胞(4～6)x10⁶个接种于细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜的DMEM完全培养基；

(4)将步骤(2)中所得的混合液加入到步骤(3)所得的接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜培养基，继续培养；

(6)48h后收集第一批病毒液，并加入新鲜培养基继续培养；

(7)72h后收集第二批病毒液；

(8)将收集的病毒液置于超滤管中，浓缩，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用；

(9)倍数稀释法检测浓缩病毒的滴度。

4.根据权利要求3所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所加入的包装质粒为质粒PMD2.G，所述包膜质粒为质粒PSPAX2。