[发明专利]一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用

摘要

本申请涉及一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用。刺激隐核虫全虫疫苗的批文申请和产业化遇到巨大挑战，主要因为该寄生虫无法进行离体培养，必须在鱼体上才能进行繁殖，因而难以获得足够的虫体用以生产疫苗，更为重要的是难以制订规范的生产流程和质量标准，这迫使我们向更深层次进行研究，开发基因工程疫苗。本发明从刺激隐核虫转录组数据库中筛选出表面蛋白C1候选基因，并在四膜虫上表达出重组蛋白制备疫苗用以免疫海水鱼，通过检测疫苗的免疫原性和保护性，筛选到刺激隐核虫有效的保护性抗原基因。

主权项

一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用，其特征在于，步骤如下：一、刺激隐核虫传代：将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500L海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊；包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。二、斜带石斑鱼的暂养：整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录；实验鱼暂养2周，水温为25℃，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料；试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。三、刺激隐核虫总RNA的提取；四、一链cDNA的合成：1)按以下体系添加试剂：Total RNA，1μg；DNase I buffer，1μl；DNase I，1μl；最后加RNase free water至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组DNA污染；2)反应结束后向上述体系中加入1μl 25mM的EDTA，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活DNase I；3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；4)cDNA合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的RNA溶液，11μl；10pmol/μl的Oligo(dT)20，1μl；5×RT Buffer，4μl；dNTP Mixture(各10mM)，2μl；10U/μl的RNase Inhibitor，1μl；ReverTra Ace，1μl；Total Volume 20μl；反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min；反应产物转到‑20℃保存备用。五、表面蛋白C1基因开放阅读框(ORF)的克隆：结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白C1基因ORF的引物(5’到3’)：C1 F，ATGTAAAAGATTTTAGCTATTTTATT；C1 R，TCATTTGAATAAAAGAGCAAAG；模板使用刺激隐核虫一链cDNA，引物使用C1 F/R，PCR反应体系如下：一链cDNA，2μl；10μM的C1 F，2μl；10μM的C1 R，2μl；PrimeSTAR MAX mix，25μl；加H2O至50μl；PCR反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；回收目的条带，产物与克隆载体pEASY‑Blunt Cloning Vector进行连接，连接反应体系如下：PCR回收产物，4μl；pEASY‑Blunt Cloning Vector，1μl；混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞，从‑80℃取出Trans1‑T1感受态细胞50μl置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mL LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl菌液涂布于含有X‑gal、IPTG和卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养；次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀；取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定；反应体系如下：菌液，1μl；10μM的Primer M13F，1μl；10μM的Primer M13R，1μl；Premix Taq，25μl；加H2O至50μl；PCR反应条件为：先95℃预变性10min；然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，3min，共35个循环；最后72℃延伸10min；电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并测序。六、四膜虫rDNA表达载体的构建：1)候选基因的结构特征分析利用软件对表面蛋白C1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、信号肽序列分析和GPI锚定位点分析；2)表面蛋白C1基因的改造以目的基因cDNA为模板通过PCR对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点BamH和XhoI、去除GPI‑Anchor结构、增加标签、设计TEV位点；3)候选基因与穿梭载体的连接把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体pTIEV4进行双酶切，酶切位点为BamH和XhoI，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定；4)表达载体的构建把上述穿梭载体和pD5H8载体进行单酶切，酶切位点为NotI，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rDNA表达载体。七、四膜虫rDNA表达载体的转化和阳性虫株筛选：1)四膜虫的准备用NEFF培养基分别培养两种交配型的四膜虫，当细胞浓度达到105个/ml以上时转入饥饿液中震荡培养7‑14小时，然后静置培养9.5h，如果镜检发现细胞配对比率达到80％以上，且在荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；2)转化将浓缩的表达载体(浓度＞1ug/ul)包被金颗粒，利用BIO‑RAD PDS‑1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；3)筛选将转化后的细胞培养在NEFF培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000‑10000个外源基因的工程四膜虫。八、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：1)当细胞浓度达到105个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mM CdCl2，诱导四膜虫表达；2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经硫酸铵沉淀、透析和Ni‑NTA树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白；九、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护性的检测：把重组蛋白与弗氏佐剂混合制成疫苗免疫石斑鱼，首次免疫两周后加强免疫一次；首次免疫后第4周，用刺激隐核虫幼虫攻毒，检验疫苗的免疫保护性。十、亚单位疫苗的制备：把表面蛋白C1重组蛋白溶于PBS后，加入等剂量的弗氏佐剂，在冰上用组织匀浆器将抗原与佐剂混合均匀，制成亚单位疫苗，4℃保存。