[发明专利]基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法

摘要

基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，包括用促凝采血管收集人静脉血4mL，室温凝固30min，离心1000g×15min；提取血凝块基因组DNA；初步确认基因组DNA的完整性、浓度和纯度；采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA；进行甲基化PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像系统观察、拍照；采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收18μL PCR产物，通过载体连接将2μL纯化回收后的PCR产物转化入Trans1‑T1感受态细菌中，开展蓝白克隆斑筛选，并鉴定阳性克隆；选取阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/mL卡那霉素单抗LB液体培养基中，在37℃恒温200rpm/min震荡培养8‑12h后，取变浑浊的样本进行测序。本发明能成功地检测出FOXP3基因启动子区特定序列5个CpG位点甲基化的程度。

主权项

一种基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，包括：步骤1，用促凝采血管收集人静脉血4mL，室温凝固30min，离心1000g×15min，而后将1mL血凝块分装进1.5mL Axygen PE管，保存于‑80℃冰箱中；步骤2，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取步骤1中血凝块基因组DNA；步骤3，通过0.8％‑1.0％的琼脂糖凝胶电泳初步确认步骤2中的基因组DNA的完整性、浓度和纯度，并将检测合格的DNA样本置于‑20℃冰箱备用；步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，并将修饰好的DNA样本置于‑20℃冰箱备用；步骤5，进行甲基化PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像系统观察、拍照；步骤6，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收步骤5中的18μL PCR产物，通过载体连接将2μL纯化回收后的PCR产物转化入Trans1‑T1感受态细菌中，开展蓝白克隆斑筛选，并通过通用引物(M13F和M13R)做PCR扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察、拍照，以鉴定阳性克隆；步骤7，选取步骤6中阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/mL卡那霉素单抗LB液体培养基中，在37℃恒温200rpm/min震荡培养8‑12h后，取变浑浊的样本进行测序。