[发明专利]一种植物质体表达载体的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种植物质体表达载体的构建方法及应用，构建了gfp表达盒和aadA表达盒，把去除多克隆位点的质粒pBluescript II sk(+)载体片段、gfp表达盒、aadA表达盒、与质体基因组同源的左同源片段和右同源片段这5个片段通过无酶克隆技术一步转入大肠杆菌中，验证正确的载体命名为pYY12。利用金粉包裹pYY12质粒DNA导入质体基因组中，Southern blot证实目的基因导入质体基因组中，Northern bolt显示了GFP基因的转录水平，激光共聚焦显微镜证实了GFP的存在位置，SDS‑PAGE法分析了GFP蛋白的高水平的积累量，达到总可溶性蛋白的9％左右。

主权项

1.一种植物质体表达载体的构建方法，其特征在于，通过合成生物学技术进行多元件表达盒的构建，运用无酶克隆技术把多个构件一步法克隆到大肠杆菌中，加快质体表达或转化载体的构建的速度，并通过基因枪法把DNA定点导入到质体基因组中，并成功表达；将多个基因表达盒简单有效地组装到一个质体转化载体中，构成多基因或多表达盒结构的质体转化载体，为质体基因工程研究和应用提供有效的工具；所述植物质体表达载体的构建方法具体包括以下步骤：步骤一、gfp表达盒组装：gfp表达盒是由来源于烟草rRNA操纵子的启动子Prrn和来源于T7噬菌体的T7G10序列组成的强启动子、来源于水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的变异GFP基因和来源于大肠杆菌rrnB终止子序列组成，利用计算机辅助设计把这3个片段设计组合在一起通过基因合成gfp表达盒，gfp表达盒序列见序列表，如SEQ ID NO:1所示；步骤二、aadA表达盒组装：aadA表达盒是由来源于莱茵衣藻的psbA基因的启动子PpsbA、来源于细菌的aadA基因和来源于莱茵衣藻的rbcL基因终止子序列和两端同向的loxp序列组成，如SEQ ID NO:2所示；步骤三、质体同源片段克隆：由质体基因组psaB基因的部分序列、rps14基因序列和trnfM基因序列组成的质体左同源片段，由质体基因组psbZ基因序列trnfM基因序列组成的质体右同源片段，质体转化的插入位点为trnfM和trnG之间的非编码区，左同源序列和右同源序列见序列表，如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；步骤四、大肠杆菌表达载体骨架的克隆：为去多克隆位点MCS的质粒pBluescript II sk(+)序列，大肠杆菌表达载体骨架序列见序列表，如SEQ ID NO:5所示 ；步骤五、构建植物质体表达载体：把合成的gfp表达盒、合成生物学合成的aadA表达盒、质体左同源片段、质体右同源片段和大肠杆菌转化载体骨架这5个片段通过利用计算机辅助设计一步法克隆到大肠杆菌Xl10‑gold宿主菌中，在感受态细胞效率在2*10⁸个/μg时，能到19个的阳性克隆，经测序验证后均正确；利用计算机 辅助设计把合成生物学技术合成的gfp表达盒、利用合成生物学合成的aadA表达盒、质体左同源片段、质体右同源片段和大肠杆菌转化载体骨架这5个片段合理地组合在一起；设计一对引物P55'GAGAAGCAAATACAACGGGTACGCTAATCACCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG 3'带有30bp的左同源序列和P6 5'TAATAACCCCTAAAGAAGCTAGAGCAAGGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCG 3'，带有30bp的右同源序列， 以质粒pBluescript II sk(+)为模板，通过PCR扩增去除多克隆位点MCS的质粒pBluescript II sk(+)得到片段，命名为片段1；设计引物P75'GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCCTTGCTCTAGCTTCTTTAGGGG 3'带有30bp的质粒pBluescript II sk(+)序列和P8 5'TCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAAACCCTAAAATAGTTTGGCAAAACAAG 3'带有30bp的gfp表达盒序列，以烟草叶绿体基因组DNA为模板，克隆左同源序列，命名为片段2；设计引物P95'TTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACTAGTAATTAATTCCCGCCTTTCGC 3'带有30bp的aadA表达盒序列和P10 5'TTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTGATTAGCGTACCCGTTGTATTTGC 3'带有30bp的质粒pBluescript II sk(+)序列，以烟草叶绿体基因组DNA为模板，克隆右同源序列，命名为片段3；以基因合成的aadA表达盒序列为模板，设计一对引物P11 5' CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGAAAAGTGAGCTATTAACGCGTCC 3'带有30bp的gfp表达盒序列和P12 5'AAAGCGAAAGGCGGGAATTAATTACTAGTATAACTTCGTATAATGTATGC TATACGAAG 3'带有30bp的右同源序列，通过PCR扩增得到片段，命名为片段4；以基因合成的GFP基因表达盒序列为模板，设计一对引物P13 5'CATCTTGTTTTGCCAAACTATTTTAGGGTTTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC 3'带有30bp的右同源序列和P14 5'ATAGGACGCGTTAATAGCTCACTTTTCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG 3'带有30bp的aadA表达盒序列， 通过PCR扩增得到片段，命名为片段5；5个片段通过无酶克隆的方法克隆到大肠杆菌Xl10‑gold中，5个片段按1:2:2:2:2的比例混匀，然后加入50微升的大肠杆菌Xl10‑gold感受态细胞中，最后涂布相应的抗生素平板。