[发明专利]一种植物质体表达载体的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种植物质体表达载体的构建方法及应用，构建了gfp表达盒和aadA表达盒，把去除多克隆位点的质粒pBluescript II sk(+)载体片段、gfp表达盒、aadA表达盒、与质体基因组同源的左同源片段和右同源片段这5个片段通过无酶克隆技术一步转入大肠杆菌中，验证正确的载体命名为pYY12。利用金粉包裹pYY12质粒DNA导入质体基因组中，Southern blot证实目的基因导入质体基因组中，Northern bolt显示了GFP基因的转录水平，激光共聚焦显微镜证实了GFP的存在位置，SDS‑PAGE法分析了GFP蛋白的高水平的积累量，达到总可溶性蛋白的9％左右。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种植物质体表达载体的构建方法及应用。

背景技术

近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化与核基因转化相比有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无载体序列、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，特别2015年3月份在Sciences上关于长链dsRNA抗马铃薯甲虫方面的研究(Jiang Zhang,2015)，可以预见质体基因转化将在植物植保方面发挥着重要作用。

近年来，克隆技术飞快发展，特别是基于同源重组的无缝连接克隆方法如雨后春笋，得到了蓬勃的发展，例如the Creator system，the Gateway system，the univectorsystem，Gibson assedbly system，In-fusionTM-assembly无缝工程，无酶克隆(seamlessenzyme-free cloning，SEFC)，sequence-and ligation-independent PCR克隆方法，MAGIC-mating-assisted genetically integrated cloning,Multiple DNA Fragmentswith Short End Homologies。

合成生物学自诞生之日起就备受人们关注。合成生物学的目的在于简化复杂的自然生物系统，将其变为简单、可靠、质量可控的模块或者零件。随着引物合成、基因合成和测序等技术的进步。人工合成DNA价格的大幅下降，使得经过密码子优化的基因、启动子及其他调控元件的使用更加广泛，甚至出现了完全由人工合成的基因组。高通量测序技术的快速发展使得测序的速度空前提高，使得测序成本也持续下降，不断有新的物种基因组数据被公开。基因元件功能表征和标准化是设计和构建具有新特征生物的关键步骤，越来越多的基因元件被构建和测试。

目前植物质体转化载体的构建方法有通过定点诱变掉同源片段的限制性酶切位点来增加多克隆位点区的限制性酶切位点构建质体转化载体的方法(Sugey RamonaSinagawa-García,2009)，还有通过Gateway系统来构建质体转化载体的方法(JohannaGottschamel,2013)。

DNA导入质体的方法有许多，如花粉管导入法、农杆菌介导转化法、PEG介导转化法、激光微束转化法和基因枪法，最常用的是基因枪法。

发明内容

本发明提出了一种植物质体表达载体的构建方法及应用，通过合成生物学技术进行多元件表达盒的构建，运用无酶克隆技术把多个构件一步法克隆到大肠杆菌中，从而节省成本，加快质体表达或转化载体的构建的速度，并通过基因枪法把DNA定点导入到质体基因组中，并成功表达。将多个基因表达盒或具有长链双向启动子结构的dsRNA和siRNA简单有效地组装到一个质体转化载体中，构成多基因或多表达盒结构的质体转化载体，为质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

其技术方案如下：

一种植物质体表达载体的构建方法，包括以下步骤：