[发明专利]一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法

摘要

本发明公开了一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法，本发明采用了经过修饰的寡聚核苷酸引物组合，通过多重PCR扩增的方法去除豇豆宿主来源的ITS基因的扩增，与此同时豇豆内生真菌的ITS基因的扩增不受影响，最终通过高通量测序的方法我们可对豇豆内生真菌(含致病微生物)的种类及丰度能够有一个详尽的调查和了解，对于豇豆内生真菌的鉴定提供了一个可靠的新途径。相对传统的分离纯化后鉴定的方法，本发明克服了已有的技术局限性。通过本发明可降低复杂操作过程中带来的环境污染，所需样本量极少，试验操作简便易行，可极大地提高豇豆真菌性病害研究水平。

主权项

一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：1)植物预处理：取豇豆根新鲜样本0.5‑1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％‑75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3‑5遍彻底去除样本表面消毒剂；2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，随后通过CTAB法纯化样本总DNA；3)样本ITS基因的扩增：3.1)ITS基因全长的乳液PCR扩增：该步骤采用的技术方案是：a.设计2对引物NSNL和ITS3/ITS4均以真菌和豇豆ITS基因为模板，其中NSNL引物红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制豇豆基因组来源的污染，ITS3/ITS4引物对用于豇豆ITS基因的扩增；b.配置豇豆内生真菌ITS基因的乳液PCR混合液，该混合液为乳液发生剂和PCR扩增缓冲液一；c.将步骤b用于扩增豇豆内生真菌ITS基因的乳液PCR混合液移入0.2ml PCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68‑70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温；d.向步骤c每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2‑丁醇，震荡混匀后以13200×g离心5分钟，离心完成后取下层水相溶液为模板进行ITS基因高变区/保守区扩增子扩增；3.2)ITS基因高变区/保守区扩增子扩增：该步骤以3.1)中d步骤水相反应产物为模，使用ITS3L/ITS4L引物在PCR扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68‑72℃30s，20个循环；68‑72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成；4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：4.1)豇豆内生真菌ITS基因扩增子纯化回收将3.2)步骤的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在250‑450bp左右的目标条带，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5V/cm，20min；4.2)扩增子测序文库构建文库构建使用TruSeq DNA PCR‑Free Sample Prep Kit；4.3)Illumina HiSeq测序测序平台为Illumina HiSeq 2500，测序模式为V2SBS快速250PE模式；4.4)测序数据生物信息学分析测序得到的PE reads首先使用FLASH软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，得到可供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，统计和作图主要使用R完成，主要操作步骤如下：a.根据Barcode区分样品；b.使用Uchime去除嵌合体；c.在97％的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTU聚类；d.挑选出OTU的代表性序列；e.使用UNITE数据库进行物种分类信息的划分。