[发明专利]一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种豇豆内生真菌核酸靶序列片段的扩增技术，具体是一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法。

背景技术

蔬菜真菌性病害约占到病害种类的80％以上，蔬菜被真菌侵染所造成的病害相当严重。真菌可通过根际土壤或风雨条件下的孢子由表皮侵入寄主，也会通过伤口等侵入，致病真菌残留于病残体、种子、土壤等越冬，遇适宜条件便可危害寄主。

豇豆作为全球范围内最重要的豆类作物之一，广泛栽培于热带亚热带地区和部分温带地区、地中海盆地和美国南部。目前全球豇豆种植面积在1250万公顷以上，年产量超过300万吨。豇豆作为我国重要的常规蔬菜品种之一，常年栽培面积超过蔬菜种植面积的10％。在豇豆生产中，由于栽培管理不当或环境条件的影响，容易造成病害流行，导致产量和品质严重受损。露地栽培的豇豆中，根腐病、锈病、煤霉病、白粉病等真菌性病害通常会对生产造成极大的影响。如何对致病真菌进行快速地定性定量检测是豇豆疾病预防与控制的关键问题。

传统的真菌性病害的检测方法主要包括洗涤镜检、保湿培养、致病性测定和PCR检测等方法。这些方法虽然可对病原微生物进行定性检测，但受到技术自身的限制，传统方法并不能一次性检测出复杂样本中所有病原微生物。因此，为了进行病原微生物的早期预防和全面筛查，植物内生微生物高通量测序技术近几年被广泛应用在植物病害检测等领域，其具有快速、可靠、分辨率高、重复性好等优点，这对于植物病害的研究提供了可重复的定量研究方法。通过高通量测序的方法，我们可对植物内生真菌(含致病真菌)的相互作用进行全面的研究。植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存等的关系，其产生的活性物质在植物抗病等产领域有着巨大的应用前景。但是由于真核生物ITS基因的高度同源性，即使采用高通量测序进行相关研究也会因为植物宿主本身基因组的干扰，造成植物内生真菌的研究处在基础研究水平。

发明内容

本发明的目的在于为了克服豇豆内生真菌传统研究方法中需培养分离和豇豆基因组干扰等技术局限，提供一种新的豇豆内生真菌鉴定方法，通过本发明可通过高通量测序分类鉴定数据有针对性的选择性培养植物内生真菌，相对于传统方法，采用本发明的方法可同时研究同一样本内所有的内生真菌。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌ITS基因扩增方法，包括以下步骤：

1)植物预处理：取豇豆根新鲜样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；

2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，随后通过CTAB法纯化样本总DNA；

3)样本ITS基因的扩增：

3.1)ITS基因全长的乳液PCR扩增：该步骤采用的技术方案是：

a.设计2对引物NSNL和ITS3/ITS4均以真菌和豇豆ITS基因为模板，其中NSNL引物红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制豇豆基因组来源的污染，ITS3/ITS4引物对用于豇豆ITS基因的扩增；

b.配置豇豆内生真菌ITS基因的乳液PCR混合液，该混合液为乳液发生剂和PCR扩增缓冲液一；

c.将步骤b用于扩增豇豆内生真菌ITS基因的乳液PCR混合液移入0.2ml PCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温；

d.向步骤c每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心5分钟，离心完成后取下层水相溶液为模板进行ITS基因高变区/保守区扩增子扩增；

3.2)ITS基因高变区/保守区扩增子扩增：该步骤以3.1)中d步骤水相反应产物为模，使用ITS3L/ITS4L引物在PCR扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成；

4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：

4.1)豇豆内生真菌ITS基因扩增子纯化回收