[发明专利]运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法

摘要

本发明涉及大麦转基因材料的构建，旨在提供一种运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法。该方法包括下述步骤gRNA靶位点的选择、gRNA片段的克隆、GG(gRNA‑gRNA)片段的连接、连接产物的PCR扩增、纯化产物和目标载体的酶切、纯化产物和目标载体的连接反应、连接产物转化大肠杆菌感受态、农杆菌介导的大麦转基因、阳性转基因植株的筛选、突变体测序。本发明利用先进的基因编辑技术‑CRISPR‑Cas9系统对大麦VE合成通路中的关键基因(HPT)进行靶向基因编辑，获得有效的功能缺失突变体，为大麦中生物活性物质的研究创造条件。

主权项

运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gRNA靶位点的选择由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR‑Cas9技术的靶位点设计原则，选择gRNA靶位点在基因5’端的外显子区；(2)gRNA片段的克隆以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个部分重叠的片段L1、L2、L3、L4；其中，PCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×Phusion HF Buffer 10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs 4μL；pGTR plasmid 0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系；上下游引物的序列如SEQ ID NO：1～8所示：PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR反应后，取5～10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；(3)gRNA‑gRNA片段的连接根据测定的PCR产物浓度，将L1、L2、L3、L4四个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行；取L1、L2、L3、L4各2μL，与10μL T7ligase buffer、1μLBsaI‑HF、0.5μL T7ligase、0.5μL水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃，5min；20℃，10min；30‑50个循环；(4)连接产物的PCR扩增；连接反应结束后，取连接产物1μL，加19μL水稀释，将稀释后的产物作为模板，进行PCR扩增；PCR结束后，取5μL产物进行电泳检测，并将产物纯化；产物大小为500bp；PCR所用引物的序列如SEQ ID NO：9～10所示；(5)纯化产物和目标载体的酶切FokI酶切纯化产物暴露黏性末端，同时BsaI酶切空载体pRGEB32；酶切体系为50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32；酶切时间3‑4h，酶切温度37℃；用2％琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物，测定浓度；(6)纯化产物和目标载体的连接反应取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng)，T4DNA ligase 1μL，10×T4DNA ligase Buffer 1μL，加三蒸水至20μL，4℃连接过夜；(7)连接产物转化大肠杆菌感受态将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，37℃过夜；挑取单菌落，摇菌6‑8h，提取质粒，PCR鉴定目标片段是否连入载体；鉴定正确的质粒送去测序，将测序结果正确的质粒，电转化农杆菌AGL1；(8)农杆菌介导的大麦转基因以Golden Promise野生型大麦的幼胚为外植体材料，以AGL1农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株；(9)阳性转基因植株的筛选提取转基因植株的基因组DNA，在三个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；(10)突变体测序将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体测序，确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。