[发明专利]运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法

权利要求书

1.运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则，选择gRNA靶位点在基因5’端的外显子区；

(2)gRNA片段的克隆

以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个部分重叠的片段L1、L2、L3、L4；其中，

PCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×Phusion HF Buffer 10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs 4μL；pGTR plasmid 0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系；上下游引物的序列如SEQ ID NO：1～8所示：

PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；

PCR反应后，取5～10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；

(3)gRNA-gRNA片段的连接

根据测定的PCR产物浓度，将L1、L2、L3、L4四个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行；取L1、L2、L3、L4各2μL，与10μL T7ligase buffer、1μLBsaI-HF、0.5μL T7ligase、0.5μL水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃，5min；20℃，10min；30-50个循环；

(4)连接产物的PCR扩增；

连接反应结束后，取连接产物1μL，加19μL水稀释，将稀释后的产物作为模板，进行PCR扩增；PCR结束后，取5μL产物进行电泳检测，并将产物纯化；产物大小为500bp；

PCR所用引物的序列如SEQ ID NO：9～10所示；

(5)纯化产物和目标载体的酶切

FokI酶切纯化产物暴露黏性末端，同时BsaI酶切空载体pRGEB32；

酶切体系为50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32；

酶切时间3-4h，酶切温度37℃；用2％琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物，测定浓度；

(6)纯化产物和目标载体的连接反应

取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng)，T4DNA ligase 1μL，10×T4DNA ligase Buffer 1μL，加三蒸水至20μL，4℃连接过夜；

(7)连接产物转化大肠杆菌感受态

将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，37℃过夜；挑取单菌落，摇菌6-8h，提取质粒，PCR鉴定目标片段是否连入载体；鉴定正确的质粒送去测序，将测序结果正确的质粒，电转化农杆菌AGL1；

(8)农杆菌介导的大麦转基因

以Golden Promise野生型大麦的幼胚为外植体材料，以AGL1农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株；

(9)阳性转基因植株的筛选

提取转基因植株的基因组DNA，在三个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；

(10)突变体测序

将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体测序，确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。