[发明专利]运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法

说明书

技术领域

本发明涉及大麦转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR-Cas9系统敲除HvHPT(MLOC_37476)基因的应用。

背景技术

维生素E(vitamin E，VE)是由光合生物合成的生育酚类化合物的总称。根据侧链是否饱和，VE可以分为生育酚(tocophero1)和生育三烯酚(tocotrieno1)两大类。根据芳香环上甲基位置和数目的不同，每类又可分为α，β，γ，δ四种形式，其中，α-生育酚活性最高。近些年来，由于生育三烯酚在某些方面更优越的生物学特性，备受人们关注。不仅表现在抗氧化活性，在降胆固醇、预防糖尿病、促进骨吸收、抗癌、神经保护等方面也有一定的作用。

大麦是世界上四大粮食作物之一，主要用于食品生产、动物饲养、啤酒制造等领域。另外，由于大麦含有丰富的生物活性物质如β-葡聚糖、酚类物质、维生素E等，也常被用作功能食品开发的原料。大麦谷粒，含有丰富的生育三烯酚，大概占VE总含量的70％，是研究生育三烯酚的好材料。因此利用基因工程手段调控大麦谷粒中的VE合成通路，可以提高大麦生育三烯酚的含量，从而起到增加大麦谷粒营养成分的作用。目前由于大麦突变体库的缺乏，限制了大麦VE合成通路中相关基因的功能研究。

近年来发展起来的以CRISPR-Cas9为代表的新一代基因组编辑技术，为植物基因工程带来了新的革命，已成为基因功能研究和作物品质改良的重要手段之一。运用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术改造相关基因，并通过自交、分子鉴定和后代筛选，获得“非转基因”大麦新材料，可为今后将成果应用于生产实践提供依据和技术支持。但是因为大麦基因转化效率低，稳定转基因材料的获得周期长，目前运用CRISPR-Cas9系统研究大麦基因的报导很少见。因此，应用CRISPR-Cas9技术敲除大麦VE合成通路中的关键基因(HvHPT)而获得的大麦突变体，可为HvHPT基因的功能研究提供可靠材料。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，以获得HPT基因突变的理想突变体。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则，应尽量将gRNA靶位点设计在外显子区并且要设计在基因的5’端(因该基因编码的是蛋白质，5’端编码的正好是蛋白质的功能区域)。

(2)gRNA片段的克隆

以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个片段L1、L2、L3、L4部分重叠的片段，引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：

L1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATG GGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG

L1-R：CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG

L2-F：TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA

L2-R：CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG

L3-F：TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA

L3-R：CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG

L4-F：TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA

L4-R：

TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG

PCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×Phusion HF Buffer 10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs 4μL；pGTR plasmid 0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系。

PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；

PCR反应后，取5-10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；

(3)GG(gRNA-gRNA)片段的连接