[发明专利]一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法

摘要

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，本发明涉及一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因NHEJ效率的方法。具体来说，本发明设计筛选出高效干扰pten基因表达的小分子干扰RNA，使用CRISPR/Cas9系统靶向敲除基因时，共转染该小分子RNA，可以有效的提高靶基因的NHEJ效率。在细胞多个靶点验证，均有明显提高，该方法成本低、操作简单、效率高，对于CRISPR/Cas9技术的效率和应用具有很好的促进作用。

主权项

本发明涉及一种可以有效提高CRISPR/Cas9技术在敲除基因应用的方法，其特征在于：转染CRISPR/Cas9载体的同时，共转染本发明中涉及的小分子干扰RNA，可以有效提高CRISPR/Cas9系统靶位点形成的NHEJ的效率，具体包括如下步骤：（1）设计pten基因的gRNA，每个基因3个靶位点，合成对应的oligo和用BbsI酶切过的PX458 载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确认gRNA表达载体构建正确；（2）将步骤（1）构建的gRNA载体与小干扰RNA共转染转染293T细胞，另取构建的gRNA载体转染293T细胞（作为对照组）；（3）将步骤（2）转染24~48小时，细胞经流式分选，筛选出GFP标记的转染阳性细胞；（4）提取基因组，PCR扩增靶位点区域片段，将PCR产物退火，并用T7E1酶切，采用琼脂糖凝胶电泳检测，并进行灰度分析（indel）检测NHEJ效率，检测结果发现共转染小干扰RNA可以有效提高CRISPR/Cas9在靶位点形成NHEJ效率为3.39~7.8倍。