[发明专利]一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，具体涉及一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因非同源性末端接合(Non-homologous end joining，简称NHEJ)效率的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中 Type Ⅱ型的 CRISPR/Cas系统的 DNA 内切酶Cas9 只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9 蛋白外，该系统还包括两条短的 CRISPR RNAs（crRNAs）和 trans-activating crRNAs（tracrRNA）。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9 蛋白到靶序列上，并在 PAM（protospacer adjacent motif）附近特异性剪切 DNA 双链，形成 DSB（double strand break）。DSB 可以通过两种途径被修复，一种是非同源性末端接合（Non-Homologous End Joining NHEJ）DNA修复方式，另一种是同源重组修复（ Homology Directed Repair HDR) 方式。NHEJ 修复方式可能产生碱基的插入或缺失，从而产生移码突变，或者也可能突变成终止密码子，这些突变形式都可以改变目的基因的开放阅读框；HDR 方式需要一段与被剪切片段同源的模板片段来修复DSB，这种修复方式可以将被用来作为模板的同源片段的序列复制到目的基因中，所以可以利用这种修复方式将特定的基因片段引入到目的基因中。

Cas9有时较差的切割效率可能与DNA是如何修复的相关联，这是因为DNA修复机制---基本的管家酶修复DNA中的任何可能导致致命性突变的断裂或缺失---在不同细胞之间存在差异。他推断与人基因组不存在同源性的寡核苷酸可能干扰这种修复过程，从而提高基因敲除成功率。

CRISPR-Cas9基因编辑可以认为是切割和DNA修复之间的竞争：一旦Cas9进行切割，细胞精确地替换受到切割的DNA，随后Cas9再次切割这种受到替换的DNA，从而陷入一种无尽的切割和修复的循环，直到这些修复酶发生错误，这些基因最终都失去功能。这些寡核苷酸可能会降低这种修复过程的保真度，或者说让细胞切换到一种更加容易发生的修复过程，从而允许Cas9更容易让基因发生断裂。本发明可以极大的提高了CRISPR/Cas9敲除效率，同时使该技术更加的简单、易操作。

发明内容

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，本发明涉及一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因NHEJ效率的方法。具体来说，本发明设计筛选出高效干扰pten基因表达的小分子干扰RNA，使用CRISPR/Cas9系统靶向敲除基因时，共转染该小分子RNA，可以有效的提高靶基因的NHEJ效率。在细胞多个靶点验证，均有明显提高，该方法成本低、操作简单、效率高。对于CRISPR/Cas9技术的效率和应用具有很好的促进作用。

本发明技术方案如下：

1、高效干扰人pten基因表达的小分子干扰RNA，设计、合成以及筛选；

2、 设计、构建敲除人pten基因的CRIPSR/Cas9载体，并共转染筛选得到的小分子干扰RNA，通过检测靶位点产生的NHEJ效率，确认CRISPR/Cas9载体共转染小分子干扰RNA是否可以提高NHEJ效率；

3、 将小分子干扰RNA应用于多个CRISPR/Cas9靶位点编辑验证，确认小分子干扰RNA提高NHEJ效率的准确性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1 为反转录PCR检测pten基因的表达量（其中M为DL2000，1为pten-RNAi-1，2为pten-RNAi-1， 3为pten-RNAi-3，4为pten-RNAi-4，5为pten-RNAi-5，PCR扩增264bp大小片段）；

图2为Lin28a两个靶点区域PCR产物T7 Endonuclease I酶切产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果（其中A组为小干扰RNA+ PX458-Lin28A-T1 ，B组为小干扰RNA+ PX458-Lin28A-T5，C组为PX458-Lin28A-T1，D组为PX458-Lin28A-T5，E组为小干扰RNA，F组为PBS）。

具体实施方式