[发明专利]一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法

权利要求书

1.本发明涉及一种可以有效提高CRISPR/Cas9技术在敲除基因应用的方法，其特征在于：转染CRISPR/Cas9载体的同时，共转染本发明中涉及的小分子干扰RNA，可以有效提高CRISPR/Cas9系统靶位点形成的NHEJ的效率，具体包括如下步骤：

（1）设计pten基因的gRNA，每个基因3个靶位点，合成对应的oligo和用BbsI酶切过的PX458 载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确认gRNA表达载体构建正确；

（2）将步骤（1）构建的gRNA载体与小干扰RNA共转染转染293T细胞，另取构建的gRNA载体转染293T细胞（作为对照组）；

（3）将步骤（2）转染24~48小时，细胞经流式分选，筛选出GFP标记的转染阳性细胞；

（4）提取基因组，PCR扩增靶位点区域片段，将PCR产物退火，并用T7E1酶切，采用琼脂糖凝胶电泳检测，并进行灰度分析（indel）检测NHEJ效率，检测结果发现共转染小干扰RNA可以有效提高CRISPR/Cas9在靶位点形成NHEJ效率为3.39~7.8倍。

2.根据权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于：该小分子RNA具有有效下调人pten基因的表达功能。

3.根据权利要求1所述的小分子干扰RNA，其对应的RNA序列如序列表SEQ ID NO. 3-4、SEQ ID NO. 7-8和SEQ ID NO. 9-10所示。

4.根据权利要求1所述的小分子干扰RNA，为权利要求3所述的3条小分子RNA序列的等比混合物。

5.本发明涉及的小干扰RNA可以有效提高CRISPR/Cas9系统在293T细胞中靶向敲除人pten基因的NEHJ效率。

6.一种CRISPR/Cas9高效靶向敲除人pten基因的技术方法。