[发明专利]一种用于降解组测序文库构建的方法

摘要

本发明公开了一种用于降解组测序文库构建的方法包括miRNA靶基因mRNA片段的分选、miRNA靶基因mRNA片段5’端的接头连接、随机引物进行反转录、miRNA靶基因cDNA的扩增步骤。本发明技术方案无需特定3’端接头连接，操作简单，用时少，并大大降低对样品量的要求，能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因，具有高效、快捷、直观、准确的特点。

主权项

1.一种用于降解组测序文库构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）通过mRNA Capture Beads分选miRNA靶基因的mRNA片段；（2）5’接头连接mRNA片段：取20μL步骤（1）分选出的mRNA溶液中加入2μL RNA 5’Adapter B在PCR仪65℃孵育5min，冰上放置2min后加入以下试剂到PCR管中，轻轻混匀，在PCR仪37℃孵育2h；10mM ATP4μL10×Ligation Buffer4μLRNase Inhibitor1μLLigation Enhancer Mix8μLLigation Enzyme Mix1μLTotal final volume40μL（3）Beads纯化连接产物；（4） 反转录：取10μL经纯化后的连接产物分别加入1μL RT Primer(R)和1μL 10mM dNTP混匀后于65℃变性5min，立即置于冰上；加入以下试剂到PCR管中：5×First Strand Buffer4μL100mM DTT2μLRNase Inhibitor1μLTotal final volume19μL轻轻混匀，于PCR仪上25℃保温2min，加入1µL反转录酶吹打混匀在PCR仪上25℃保温10min，42℃保温40min，70℃保温15min；（5）Beads纯化步骤（4）获得的cDNA产物；（6）PCR扩增：98℃变性30s，10‑15个PCR循环，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃后续延伸10min，4℃保持；（7）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物并回收目的片段，获得高通量测序所需的降解组文库。