[发明专利]基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法

摘要

本发明属于恶性疟原虫检测技术领域，具体涉及基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，包括以下步骤步骤一，生物信息学分析，搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体阶段高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，作为平行对照；步骤二，LAMP引物设计；利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成。步骤三，模版DNA制备；步骤四，引物配制；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价。

主权项

基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，生物信息学分析：搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，做为平行对照；步骤二，LAMP引物设计：利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成；步骤三，模版DNA制备：使用血液基因组DNA提取试剂盒分别提取含有恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫的全血基因组DNA；使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取感染弓形虫的小鼠腹水DNA；上述试剂盒所提取的基因组DNA即为LAMP使用的模板DNA；步骤四，引物配制：LAMP引物存储液配制：将步骤二得到的置于1.5ml离心管的LAMP引物干粉在12000r/min下离心1min，以使粘在管盖和管壁的粉末全部集中在管底。配制母液：根据引物干粉摩尔数溶解干粉于1.5ml离心管，配制内引物(FIP/BIP)母液的浓度为200pmol/μl，外引物(F3/B3)母液的浓度为100pmol/μl，将配制好的内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室温放置5min，振荡混合均匀后放入离心机，在12000r/min下离心1min；LAMP引物工作液PM制备：取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl，最后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价：A.LAMP反应体系包括12.5μl 2×RM反应液，1μl步骤四得到的LAMP引物工作液PM，1μl和相对应基因的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超纯水至25μl，混合均匀后加入12.5μl密封液再次离心，最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，轻轻盖紧管盖，恒温金属浴内反应，终止反应后颠倒PCR管数次或1000～16000r/min离心30sec～3min，使显色液与反应混合液充分混匀，短暂离心后观察反应液颜色变化，若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，若呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增)；B.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA用超纯水进行倍比稀释，然后按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，评价所检测基因的敏感性；C.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有间日疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有约氏疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有弓形虫基因组DNA的腹水DNA；按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，以18S rRNA设计的LAMP引物作为阳性对照引物，进行特异性评价，同时设立空白对照和阴性对照。