[发明专利]一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为提取TIL细胞；将TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD‑1‑CD8+ T细胞；将纯化的PD‑1‑CD8+ T细胞加入到G‑Rex透气瓶中，用完全培养基进行培养，培养一周；快速扩增PD‑1‑CD8+ T细胞。本发明具有有效降低微生物污染率、扩增效率高、细胞毒活性高等优点。

主权项

一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞：a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用；b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm3的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm2的G‑Rex10透气瓶中；c、 向G‑Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G‑Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min；d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液；e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞；f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min；g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液；h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞；i、 从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心5min；j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD‑1‑CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD‑1‑CD8+T细胞加入到G‑Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL‑2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基 ，同时补充完全培养基，并添加6000U/ml IL‑2,每个G‑Rex10透气瓶可容纳10‑40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD‑1‑CD8+ T细胞：k、每5×106或10×106个PD‑1‑CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G‑Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD‑1‑CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基；l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G‑Rex100透气瓶中，将G‑Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养；m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G‑Rex100瓶中，补加150ml AIM‑V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL‑2，将G‑Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养；n、第11天，向每一个G‑Rex100透气瓶中补加150ml AIM‑V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL‑2，将G‑Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养；o、第14天后，收获PD‑1‑CD8+ T细胞。