[发明专利]一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法

权利要求书

1.一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：具体步骤为：

步骤一、获得TIL细胞：

（1）、提取TIL细胞：

a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用；

b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm³的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm²的G-Rex10透气瓶中；

c、 向G-Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO₂的培养箱中，孵育30min；

d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液；

e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞；

f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min；

g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液；

h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞；

i、 从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心5min；

j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；

（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；

（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基 ，同时补充完全培养基，并添加6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳10-40×10⁶个细胞，培养一周；

步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞：

k、每5×10⁶或10×10⁶个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm²、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD-1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基；

l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO₂的培养箱中进行培养；

m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm²、容积为500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养；

n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养；

o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。

2.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织不小于1cm³。

3.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。