[发明专利]一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤过继免疫细胞治疗领域领域，具体来说是一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法。

背景技术

TIL细胞疗法是免疫疗法的一种，这些年正在逐步发展，它最初的提出者是Rosenberg，TIL(Tumor infiltrating lymphocytes)指肿瘤浸润的淋巴细胞，其中主要效应细胞为CD8+T细胞，在手术切除的肿瘤组织中，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞，这些淋巴细胞中有部分是针对肿瘤特异性突变抗原的T细胞，是能够杀伤肿瘤细胞的，但是由于一些原因，例如肿瘤微环境和PD-1，他们的功能受到了抑制，不能在肿瘤组织中有效的杀伤肿瘤细胞，但是，科学家通过一些体外培养方法把这些肿瘤组织中的某类型的淋巴细胞富集起来，再回输给患者，就能够发挥抗肿瘤作用，而且联合PD-1效果会更好。

虽然TIL细胞治疗技术进入临床，对鼻咽癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、淋巴癌等晚期癌症有一定疗效，但是由于TIL细胞的获取受到局部肿瘤细胞活力、肿瘤来源及大小等因素的制约，难以获得大量增殖的且高纯度的CD8+T细胞，限制了TIL的临床疗效，另一方面，目前临床上的TIL细胞通常从肿瘤组织分离出来之后，通过IL-2、CD3抗体等细胞因子的诱导作用，扩增为CD8+T细胞，但是这样的细胞有很大一部分是表面高表达PD-1分子的细胞，其和肿瘤表面的PD-L1结合，启动了CD8+T的凋亡程序，从而抑制了CD8+T的肿瘤杀伤作用，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，极大地影响了TIL的临床疗效，也限制了其在临床上的应用。

目前，人们获得TIL细胞技术有诸多不足，要获得数量足够的用于临床治疗的PD-1-CD8+T细胞，是一项劳动和技术密集性地操作，而且目前主要使用24孔板、塑料透气平瓶和透气袋等容器，这就要求更多的人力、更多的时间、更多的培养基、更多的容器等等，也占用了更多培养箱空间，同时，比如24孔板属于一种开放式的培养系统，更容易被微生物污染，另外操作中多次扩增，也都增加了微生物污染的风险。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的临床治疗效果差、易受到微生物污染以及扩增效率低下的缺陷，提供一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法来解决上述问题。

本发明公开了一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：

步骤一、获得TIL细胞：

（1）、提取TIL细胞：

a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用；

b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm³的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm²的G-Rex10透气瓶中；

c、 向G-Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO₂的培养箱中，孵育30min；

d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液；

e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞；

f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min；

g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液；

h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞；

i、 从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心5min；

j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；

（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；