[发明专利]一种干细胞人微型器官的制备方法

摘要

本发明公开了一种干细胞人微型器官的制备方法，涉及微型器官移植技术领域。它的主要方法为利用间充质干细胞、内皮祖细胞、水凝胶中的细胞因子如胶原或纤维蛋白促进新生血管的形成,在血管系统重建后的2‑4周，交联胶原微球分泌Wnt2和HGF等因子能够促进肝细胞的增殖；它的有益效果为为那些找不到器官捐赠者的病人提供一种替代治疗甚至是治愈方法。移植1‑2年后，腹部微型器官很有可能生长到一个显著的大小，并可以替代功能受损和衰竭的肝脏。维持那些等待器官捐赠者的生命，微型器官可以为生存提供支撑。另外,利用人体微器官进行毒理学等功能试验，用同样的方法在免疫缺陷的大鼠或小鼠上也可以进行试验,为临床药物研究提供工具。

主权项

一种干细胞人微型器官的制备方法，其特征在于：它的方法为：利用间充质干细胞、内皮祖细胞、水凝胶中的细胞因子如胶原或纤维蛋白促进新生血管的形成,在血管系统重建后的2‑4周，交联胶原微球分泌Wnt2和HGF等因子能够促进肝细胞的增殖；具体的方法步骤为:步骤一：间充质干细胞的增殖：标准条件下的诱导多能干细胞，E形成后5‑9天，用胶原蛋白酶或分散蛋白酶分离出EBs细胞，用MSC培养基培养，培养基中含有PDGF，EGF和FGF，每种因子的浓度均为10ng/ml,2周后，MSC增殖高于1000倍，其中大部分的细胞都会表达类似于CD73，CD105，CD29，CD44、MSC等的标志物；步骤二：内皮祖细胞的增殖：在标准条件下的诱导多能干细胞EB形成后5‑9天后，用胶原蛋白酶或分散蛋白酶分离出EBs细胞系，用内皮细胞的培养基培养，培养中含有终浓度为10ng/ml VEGF和FGF，浓度范围在1‑100ng/ml，2周后，EPC的数量增加超过1000倍，大部分的细胞表达像CD31lowKDR+VE‑Cadherin+这类的EPC表面标志物；在细胞移植的前一天，将用SDF‑1，VEGF，HGF、微环DNA等通过核转染对EPC细胞进行瞬时转染，转染后这些因子的表达能持续一周；步骤三：MSC和EPC的培养，分离出来单个MSC和其它细胞在移植后存活率较低，然而，这些细胞以微球形式进行移植会显著提高细胞的存活率和其在有机体中的功能，因此，在干细胞移植前一天，通过悬滴法或强制离心法制成100‑10000个细胞微球后进行移植；步骤四:水凝胶制备:内皮细胞生长基质胶是一类水凝胶，利用浓度在1‑2mg/mL人的胶原蛋白，在人体正常温度条件下，一个小时就可以形成凝胶；步骤五：移植，将1mL水凝胶与MSC、EPC及肝细胞制成混合的微球，37℃孵育1h以达到最优组合模式，然后，这个凝胶被移植到通过手术处理后腹部特定的部位,或者是在超声介导下，将细胞水凝胶混合物直接注射到腹部或肝脏中使用即可；步骤六：移植后两周，一旦主要的血管系统建立，延迟释放因子WNT2和HGF会促进肝细胞的增殖，对于一些延迟释放的生长因子，向浓度为1‑2mg/mL的胶原蛋白中加入1‑10μg的WNT2和HGF，然后加入油液，并以最优的速度震荡产生50‑100μm的胶原微球，再加入戊二醛交联胶原微球，内皮细胞分泌MMP降解交联胶原，释放WNT2和HGF并且诱导干细胞的扩增，siRNA的延迟释放，敲除WW45基因，能够显著的增加鼠肝脏的大小，延迟释放WW45，siRNA可以促进干细胞、卵细胞的扩增和增加微型器官大小，细胞转染一周内，营养物质和氧气只能通过简单的扩散获得，因此，高浓度的细胞密度会导致大部分细胞死亡，最佳细胞密度为1‑5x106个/mL，0.1‑0.5x106/mL肝细胞中，MSCs与EPCs的比例以1:1‑1:5进行混合。