[发明专利]应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置

摘要

本发明涉及一种应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置。包括盒体，盒体的顶面上设置进样口、文库转移口，盒体底部分别设置1个文库收集池、1个样品池、9个试剂仓、1个废液槽，装置测序方法，步骤：将RNA文库构建所用到所有试剂都预先放入盒体底部的试剂仓中，RNA样品经反转录为cDNA、DNA片段化、末端修复、加接头、PCR扩增并纯化后，取样针把构建好的文库转移至文库收集池中，将盒体顶部的密封盖打开，通过文库转移口取出构建好的文库，然后就放到测序平台上进行测序。整个建库过程都在盒体内部完成，全程封闭，不与外界接触，不会产生污染，即使是本领域内的普通技术人员都能独立操作实施，提高了效率。

主权项

1.一种应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置的测序方法，包括盒体，盒体的顶面上设置进样口，其特征在于：还设置文库转移口，进样口、文库转移口上设置可左右滑动以封闭或打开进样口、文库转移口的密封盖，盒体底部分别设置1个文库收集池、1个样品池、9个试剂仓、1个废液槽，其中，样品池与进样口相对设置，文库收集池与文库转移口相对设置，盒体内分别设置螺杆、取样针，所述螺杆左、右两端分别经轴承三、轴承四与盒体相应侧转动连接，螺杆水平设置，螺杆的右端伸出盒体与螺杆旋钮相连，螺杆上设置连接件，该连接件与螺杆通过螺纹相连，连接件的顶面上设置有取样针容置孔，取样针容置孔的中心轴与螺杆的中心轴垂直，取样针容置孔底部固定设置第一弹簧，第一弹簧与取样针容置孔通轴设置，第一弹簧由取样针容置孔底部向上延伸并伸出取样针容置孔，取样针套设在第一弹簧内，取样针通过管道与负压发生器连通，负压发生器包括壳体、活塞和活塞杆，活塞杆上套有第二弹簧，活塞杆的自由端固定连接压杆针的左端，压杆针的右端伸出盒体，用于推进活塞杆，取样针的上方设置有压板，压板包括压板本体及与压板本体连接的压板轴，其中，压板轴与螺杆平行设置，压板轴的左端通过轴承一与盒体转动连接，压板轴的右端通过轴承二与盒体转动连接， 压板轴的右端伸出盒体与压板旋转相连，应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置测序方法，包括以下步骤：将RNA文库构建所用到所有试剂都预先放入盒体底部的试剂仓中，RNA样品经反转录为cDNA、DNA片段化、末端修复、加接头、PCR扩增并纯化后，取样针把构建好的文库转移至文库收集池中，将盒体顶部的密封盖打开，通过文库转移口取出构建好的文库，然后就放到测序平台上进行测序；试剂仓1‑9中分别盛放的试剂为试剂组合一或试剂组合二，其中，试剂组合一为：试剂仓一：RNA反转录试剂混合液；试剂仓二：DNA片段化试剂混合液；试剂仓三： EDTA 溶液；试剂仓四：无DNase、RNase水；试剂仓五：CMPμre Beads；试剂仓六：乙醇溶液；试剂仓七：DNA末端修复及加A试剂混合液；试剂仓八：Adaptor连接反应试剂混合液；试剂仓九：PCR扩增试剂混合液，试剂组合二为：试剂仓一：RNA反转录试剂混合液，试剂仓二：DNA片段化试剂混合液；试剂仓三： EDTA 溶液；试剂仓四：Nuclease‑free Water；试剂仓五：AMPμre Beads；试剂仓六：乙醇溶液；试剂仓七：DNA末端修复及加A试剂混合液；试剂仓八：Adaptor连接反应试剂混合液；试剂仓九：PCR扩增试剂混合液；当选用试剂组合一时，测序方法具体包括以下步骤：文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中，RNA浓度150‑300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78‑2.0，试剂舱1‑9中分别盛放试剂，文库制备流程如下：以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10‑15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口，1、RNA反转录为cDNA外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中3.3‑6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水9.3‑12.7 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持，2、DNA片段化反应外部机械操控盒体内部的小型移液器将试剂舱一中的cDNA溶液15 μl转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水0.8 μl到试剂舱二中，使反应总体积为20 μl，与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应，反应条件：35‑38℃ 温育25‑30分钟，然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱一，终止酶促反应，3、DNA片段纯化1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10‑15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移25 μl的磁珠液放到试剂舱二中；2）盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次混匀，室温静置5‑10分钟；3）控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离；4）盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30‑60秒；6）将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；7）重复步骤5、6；8）室温静置10‑15分钟，使磁珠在空气中干燥；9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35‑40 μl至试剂舱一中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次混匀，室温静置5‑10分钟；10）将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与PCR产物分离，4、DNA末端修复反应及加A反应：1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液25 μl至试剂舱七中，然后转移试剂舱四中的无DNase、RNase水31.5 μl至试剂舱七，利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；2）反应程序如下：12‑15℃ 15‑20 min；35‑37℃ 15‑20 min；70‑72℃ 20‑25 min；4℃保持，5、末端修复DNA的纯化1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10‑15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移65 μl的磁珠液放到试剂舱七中；2）盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次混匀，室温静置5‑10分钟；3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离；4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30‑60秒；6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；7）重复步骤5、6；8）室温静置10‑15分钟，使磁珠在空气中干燥；9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水75 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5‑10次，室温静置5‑10分钟；10）将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离，6、连接adaptor吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液65 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次混匀；反应条件：20‑25℃温育15‑20分钟，7、连接adaptor的DNA片段选择性回收1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10‑15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移83.5 μl的磁珠液放到试剂舱八中；2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次，室温静置5‑10分钟；3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离；4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱八中，静置30‑60秒；6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；7）重复步骤5、6；8）室温静置10‑15分钟，使磁珠在空气中干燥；9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次，室温静置5‑10分钟；10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离，8、PCR扩增吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段23 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应，反应程序如下：预变性 95‑98℃ 30‑45 s；变性 95‑98℃ 10‑15 s；退火 60‑65℃ 30‑40 s；延伸 70‑72℃ 30‑40 s；6‑10个循环；终延伸 70‑72℃ 4‑5 min，9、PCR产物纯化1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10‑15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移50 μl的磁珠液放到试剂舱九中；2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次，室温静置5‑10分钟；3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5‑10分钟，使磁珠和上清溶液分离；4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱九中，静置30‑60秒；6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5‑10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；7）重复步骤5、6；8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35‑40 μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5‑10次，室温静置5‑10分钟；10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离，10、取出PCR产物将试剂舱九中的PCR纯化溶液25‑30 μl转移至文库收集池，通过文库转移口从外部将PCR纯化cDNA溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在‑20℃保存。