[发明专利]一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法

摘要

本发明公开了一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明方法包括以下步骤取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株，取供体植株上的花蕾，灭菌后加入NLN‑13液体培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；加入含甘露醇的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；经热激处理或直接培养，得到子叶期胚状体；接种至再生培养基中直至再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性。本发明方法得到的小孢子质量、再生率和加倍率都得到了很大的提高。

主权项

一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株；（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN‑13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；所述的NLN‑13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2，过滤灭菌；所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2；所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%；所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN‑13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽；所述的再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g， pH5.6～6.0；（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养；所述的生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。