[发明专利]一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法

权利要求书

1.一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株；

（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2，过滤灭菌；

所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2；

所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%；

所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN-13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；

（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；

（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽；

所述的再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g， pH5.6～6.0；

（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养；

所述的生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。

2.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述的花蕾的长度为2～4mm、花粉母细胞处于单核晚期至双核早期，花蕾数目为80～100个。

3.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（2）为：从供体植株花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中再次加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；在沉淀中先加入10～20mL含甘露醇的NLN液体培养基，在显微镜下利用血细胞计数器计算小孢子细胞浓度，用一定量的含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL，再加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。

4.根据权利要求1或3所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述的过滤采用44µm无菌滤网。

5.根据权利要求1或3所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述的离心的条件为：900～1200rpm/min离心3～5min。

6.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（3）中，在黑暗条件下的培养温度为25±2℃。

7.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（3）中所述的子叶期胚状体转移至再生培养基之前需在3℃～8℃中保存。

8.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（4）中所述的培养条件为每天16小时光照和25℃下培养20～30天。

9.根据权利要求1所述的利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于：步骤（5）中所述的培养条件为每天16小时光照和25℃下培养25～30天。