[发明专利]一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法。

背景技术

油菜作为世界上第三大油料作物，满足了全世界至少13%的食用油的需求。而我国的产量位居世界首位，具有较高的经济价值。我国栽培的油菜主要有白菜型油菜（Brassica rapa，n=10）、芥菜型油菜（Brassica juncea，n=18）和甘蓝型油菜（Brassica napus，n=19）三大类型。其中因甘蓝型油菜的产量高、抗性强、品质优、口感好等特性，自引入我国后被大力推广，种植面积迅速扩增，也是目前国内油菜育种工作者主要的研究对象。在常规油菜品种选育过程中，要育成一个稳定的自交系，至少需要5年。然而，通过油菜小孢子胚胎再生技术，易于进行早期选择，可以在较短的时间里获得纯合的育种材料，显著缩短了育种年限。利用小孢子培养途径比传统选育途径具有明显的优势。通过小孢子培养得到的单倍体植株有利于筛选隐性突变体，提高选择效率，有利于隐性基因控制性状的选择；还可以快速获得自交系的超雄株，构建DH群体作为遗传图谱的构图群体等。因此，建立高效快速的油菜小孢子培养体系具有十分重要的应用价值，是植物基因工程的一个新研究方向。自Licther等（1982）首次报道甘蓝型油菜小孢子培养并获得再生植株以来，许多相关研究者对影响油菜小孢子培养及胚状体再生的诸多因素进行了研究，包括培养基组成和培养条件、供体植株基因型及其生长条件、小孢子发育时期等。但培养基成分中的渗透调节剂的研究鲜有报道。因此，寻找一种更加适合的渗透调节剂对于甘蓝型油菜小孢子的培养显得极其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，该方法小孢子出胚率高，小孢子胚状体植株再生率高，加倍率高，大大增加了培养的效率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，包括以下步骤：

（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株。

（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。

所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为： NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2。所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2。所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%，将秋水仙碱加到NLN-13液体培养基中配制得到；所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN-13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g。

（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天（直至肉眼可见胚状体时），再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体。

（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽。其中，所述再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。

（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养。将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性。其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸（NAA）0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。

本发明中：