[发明专利]GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系及其构建方法

摘要

本发明涉及一种GFPT1低表达的DU145/VCAP细胞系的构建方法。利用慢病毒体系构建GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系。转染shGFPT1及慢病毒包装质粒到HEK293T细胞中，收集病毒上清，感染DU145/VCAP细胞，通过嘌呤霉素筛选转染后的DU145/VCAP细胞，获得GFPT1低表达的DU145/VCAP稳定细胞系并且通过免疫荧光观察慢病毒的感染效率，最终经Western Blot技术检测细胞株GFPT1的表达量下调70％以上，成功构建GFPT1低表达的细胞系，可作为研究GFPT1在前列腺癌肿瘤中的分子作用机制及所参与代谢调控作用的理想细胞系。

主权项

1.一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株的构建方法，其特征在于：以前列腺癌DU145/VCAP细胞作为宿主细胞通过慢病毒感染导致细胞中GFPT1蛋白的表达量下调,包括以下步骤：1)转染前16‑24小时将1.5×106‑2×106的293T细胞接种于细胞培养皿用于慢病毒包装；2)在293T细胞中转染3‑5μg包装质粒及病毒质粒，质粒分别为质量比1:8:9‑1:9:10的包装质粒中的pVSVg:包装质粒中的PSPAX2:病毒质粒中shRNA(shRNA中包含shControl及shGFPT1片段)；3)转染8‑12h后更换培养基；4)转染后72‑96h，将上清放入离心管中，3000‑5000转离心10‑15分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒；5)感染前将7×105‑1×106个靶细胞DU145/VCAP接种于培养皿培养24‑36h，取1ml病毒液加入polybrene使其终浓度为5‑10μg/ml后,加入到预感染的DU145/VCAP细胞中；6)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后更换培养基，继续培养36h～48h；7)用含终浓度为1.5‑2μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的培养基更换感染的DU145/VCAP细胞培养的培养基,对细胞进行筛选，存活的细胞即为低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株。