[发明专利]GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系及其构建方法在审
| 申请号： | 201611133376.5 | 申请日： | 2016-12-10 |
| 公开（公告）号： | CN108611373A | 公开（公告）日： | 2018-10-02 |
| 发明（设计）人： | 朴海龙;刘静 | 申请（专利权）人： | 中国科学院大连化学物理研究所 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 | 代理人： | 马驰 |
| 地址： | 116023 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 低表达 构建 慢病毒 转染 慢病毒包装质粒 分子作用机制 前列腺癌肿瘤 稳定细胞系 细胞 代谢调控 技术检测 免疫荧光 体系构建 嘌呤霉素 感染 表达量 细胞株 病毒 筛选 下调 观察 成功 研究 | ||
1.一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株的构建方法，其特征在于：以前列腺癌DU145/VCAP细胞作为宿主细胞通过慢病毒感染导致细胞中GFPT1蛋白的表达量下调,包括以下步骤：
1)转染前16-24小时将1.5×106-2×106的293T细胞接种于细胞培养皿用于慢病毒包装；
2)在293T细胞中转染3-5μg包装质粒及病毒质粒，质粒分别为质量比1:8:9-1:9:10的包装质粒中的pVSVg:包装质粒中的PSPAX2:病毒质粒中shRNA(shRNA中包含shControl及shGFPT1片段)；
3)转染8-12h后更换培养基；
4)转染后72-96h，将上清放入离心管中，3000-5000转离心10-15分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒；
5)感染前将7×105-1×106个靶细胞DU145/VCAP接种于培养皿培养24-36h，取1ml病毒液加入polybrene使其终浓度为5-10μg/ml后,加入到预感染的DU145/VCAP细胞中；
6)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后更换培养基，继续培养36h～48h；
7)用含终浓度为1.5-2μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的培养基更换感染的DU145/VCAP细胞培养的培养基,对细胞进行筛选，存活的细胞即为低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株。
2.如权利要求1所述构建方法，通过免疫荧光及免疫共沉淀技术(Western)检测GFPT1的感染效率及表达量的变化。
3.一种采用权利要求1或2所述构建方法获得的低表达人GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞株。
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