[发明专利]GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系及其构建方法

说明书

本发明涉及一种GFPT1低表达的DU145/VCAP细胞系的构建方法。利用慢病毒体系构建GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系。转染shGFPT1及慢病毒包装质粒到HEK293T细胞中，收集病毒上清，感染DU145/VCAP细胞，通过嘌呤霉素筛选转染后的DU145/VCAP细胞，获得GFPT1低表达的DU145/VCAP稳定细胞系并且通过免疫荧光观察慢病毒的感染效率，最终经Western Blot技术检测细胞株GFPT1的表达量下调70％以上，成功构建GFPT1低表达的细胞系，可作为研究GFPT1在前列腺癌肿瘤中的分子作用机制及所参与代谢调控作用的理想细胞系。

技术领域

本发明是构建一种稳定低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞株及其构建方法，涉及生物医学领域。

背景技术

GFPT1蛋白是编码己糖胺合成的第一限速酶，这一基因催化形成6-磷酸葡萄糖胺，控制葡萄糖进入己糖胺合成途径，与细胞内的N-及O-连接的蛋白质的糖基化修饰相关。研究发现，与正常组织及细胞相比，在前列腺癌细胞及前列腺病人的组织样品中其蛋白质的O-糖基化水平明显增加，O-糖基化修饰作为潜在的营养感受器，可以调节转录、代谢等众多细胞进程，并与癌症等人类重大疾病密切相关。而己糖胺合成的限速酶GFPT1的蛋白表达水平在前列腺癌细胞中也明显增高，同时GFPT1的突变会导致形成先天的肌无力综合征。在欧洲及美国前列腺癌是男性中发病率最高的肿瘤，因此研究GFPT1对前列腺癌中新的肿瘤标志物及细胞代谢紊乱的标志蛋白的研究具有重要意义，同时也可用于前列腺癌临床早期诊断、预后判断等辅助性治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞系及其构建方法，该细胞株可作为细胞模型，用于研究GFPT1对肿瘤尤其是前列腺癌发生发展的调控机制以及对细胞代谢通路的影响等生物学功能。

本发明提供的一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株，是以前列腺癌细胞株DU145/VCAP作为宿主细胞，感染带GFPT1的shRNA基因的慢病毒，经过嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选、扩增后获得低表达GFPT1蛋白的稳定细胞株。

本发明提供的一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株的构建方法，包括如下步骤：

包装细胞的转染

1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。

2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒分别为pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。

3)转染8-12h后吸去培养基并加入3ml完全培养基。

4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶细胞感染与筛选

1)感染前24h将靶细胞DU145/VCAP接种于35mm dish或六孔板中以使第二天细胞密度达到50％左右。

2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于37℃、5％CO2培养箱内培养。

3)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cmdish中，继续培养。

4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培养基换液，等细胞长成后验证目标基因的表达。