[发明专利]一种山羊miR-27a定点修饰载体及其应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用。本发明构建山羊miR‑27a定点修饰的体系能够有效识别和修饰山羊miR‑27a启动子区中转录因子CP2的结合位点。本发明所述的miR‑27a启动子结合位点如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。本发明对山羊miR‑27a启动子区序列中的转录因子CP2集合位点进行分析，构建该结合位点的野生型双荧光素酶报告载体pGL3‑W，然后对集合位点进行碱基突变修饰，构建得到突变型双荧光素酶报告载体pGL3‑M。本发明所构建的两种双荧光素酶报告载体可用于研究山羊卵泡发育调控机制，对培育高产羔数山羊品种具有重要意义。

主权项

一种山羊miR‑27a定点修饰系统,其特征在于：由山羊miR‑27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3‑W和突变修饰后获得的载体pGL3‑M构成，所述的pGL3‑W载体包含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3‑M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR‑27a的5’UTR，通过如下步骤制备得到：(1)以登录号为NC_030814的山羊miR‑27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch‑down PCR方法克隆获得miR‑27a前体5’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；(2)利用JASPAR数据库，预测得到山羊miR‑27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3‑W，其序列如SEQ ID NO：2所示；(4)将步骤(3)构建的pGL3‑W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的突变引物，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：7所示序列的目的片段；利用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：8所示序列的目的片段；将SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQ ID NO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3‑M；融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。