[发明专利]一种山羊miR-27a定点修饰载体及其应用

说明书

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用。本发明构建山羊miR‑27a定点修饰的体系能够有效识别和修饰山羊miR‑27a启动子区中转录因子CP2的结合位点。本发明所述的miR‑27a启动子结合位点如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。本发明对山羊miR‑27a启动子区序列中的转录因子CP2集合位点进行分析，构建该结合位点的野生型双荧光素酶报告载体pGL3‑W，然后对集合位点进行碱基突变修饰，构建得到突变型双荧光素酶报告载体pGL3‑M。本发明所构建的两种双荧光素酶报告载体可用于研究山羊卵泡发育调控机制，对培育高产羔数山羊品种具有重要意义。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用，特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本发明中阐述的将miR-27a启动子区中转录因子CP2的结合位点进行修饰，从而改变CP2与miR-27a启动子的结合能力。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是由内源性基因编码的单链非编码RNA，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)左右，通过与靶基因mRNA的3’UTR互补配对来调控其转录后的表达水平(Gu,2009.Gu S,Jin L,Zhang F,Sarnow P,Kay MA.Biological basis for restrictionof microRNA targets to the 3'untranslated region in mammalian mRNAs.NatStruct Mol Biol.2009Feb；16(2):144-50)。作为一种小分子序列，miRNA可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命过程(Brennecke et al.2003.Bantam encodes a developmentally regulated microRNAthat controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid inDrosophila.Cell.113:25-26；Yu et al.2005.MicroRNA Mirn122a reduces expressionof the post-transcriptionally regulated germ cell transition protein 2(Tnp2)messenger RNA (mRNA)by mRNA cleavage.Biology of Reproduction.73:427-433)。例如，miR-21、miR-212和miR-132在小鼠颗粒细胞中呈显著的上调表达，并且当miR-21的表达量降低时会导致颗粒细胞凋亡(Carletti et al.,2010.Carletti MZ,Fiedler SD,Christenson LK.MicroRNA 21blocks apoptosis in mouse periovulatory granulosacells.Biol Reprod.2010Aug 1；83(2):286-95)。在小鼠颗粒细胞中筛选出多个受TGF-β1信号调控的miRNA，其中miR-224可以靶向作用于Smad4基因来调控颗粒细胞的增殖(Yao etal.,2010.Yao G,Yin M,Lian J,Tian H,Liu L,Li X,Sun F.MicroRNA-224is involvedin transforming growth factor-beta-mediated mouse granulosa cellproliferation and granulosa cell function by targeting Smad4.MolEndocrinol.2010Mar；24(3):540-51)。有国外有研究团队通过高通量检测，在颗粒细胞中筛选出大量抑制雌激素分泌的miRNA，此外miR-28,miR-126,miR-105和miR-188等还可同时抑制雄激素和孕酮的分泌(Sirotkin et al.,2009.Sirotkin AV,Ovcharenko D,Grossmann R,LaukováM,Mlyncek M.Identification of microRNAs controlling humanovarian cell steroidogenesis via a genome-scalescreen.J Cell Physiol.2009May；219(2):415-20)。Dicer1-/-雌鼠的卵母细胞中纺锤体发生异常，导致其不能完成第一次减数分裂(Murchison et a1.,2007.Murchison EP,Stein P,Xuan Z,Pan H,Zhang MQ,Schultz RM,Hannon GJ.Critical roles for Dicer in the female germline.GenesDev.2007Mar 15；21(6):682-93)。对于卵泡发育而言，miRNA是一类发挥重要调控作用的小分子调控物。