[发明专利]一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法

摘要

本发明题为《一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法》，属于生物领域。鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。印中杂交南瓜砧木品种繁多外观相似，利用形态指标甄别真伪，耗时长可靠性差，为此，发明一种利用分子标记鉴定品种真实性的方法成为当务之急。技术方案为利用5对SSR引物(SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10)对三个砧木品种及对照材料进行PCR扩增，产生的9个差异位点经过“1”和“0”赋值，构建品种指纹图谱用以真实性鉴定。发明以更灵敏的鉴定手段、更低的时间人工成本，对印中杂交南瓜砧木品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’进行更准确更有效的鉴定与保护。

主权项

一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性的方法，包括以下步骤：(1)取样：播种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照材料，待植株长至5‑6片真叶时，采集嫩叶1g，‑80℃保存；(2)DNA提取：参照CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA；(3)PCR扩增：混样体系为15μl，包括1.5μl dNTP(1.25mM)，1.5ul 10×buffer，1.5ul MgCl2(25mM)，2.0ul引物(5mM；SSR两条引物分别添加1.0ul)，5ul DNA(10ng/ul)，0.05ul Taq(1U)，3.45ul超纯水。PCR扩增程序为：预变性94℃1min；变性93℃1min，退火40℃1min，延伸72℃2min(40个循环)；延伸72℃1min；(4)PCR产物检测：使用2.5％高分辨率标准凝胶琼脂糖(DNA片段分离范围40‑1Kbp)。添加20μl EB(ethidium bromide，溴化乙锭)显色。在PCR产物中加入2μl Loading Dye，电泳2‑3小时，电压200‑250v。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果；(5)数据收集与分析：对5对SSR引物N11/12、N41/42、N51/52、N121/122和N155/156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’的扩增结果进行赋值，某等位基因扩增出条带的记为“1”，同一位点无扩增条带的记为“0”。将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串，即构成品种指纹图谱(表1)。利用7个分子标记产生的15个多态性位点，构建‘甬砧7号’的指纹图谱；其中，所述5对SSR引物中N11/12的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，N41/42的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，N51/52的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，N121/122的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，N155/156的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。