[发明专利]一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法

说明书

一、技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及甬砧系列印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’真实性的一种鉴定方法。

二、背景技术

西瓜枯萎病引发连作障碍，在瓜类种植区普遍发生，是瓜类生产的重大难题。据统计，每年西瓜枯萎病的发病率可达10-30％，严重地块甚至绝产，造成巨大经济损失。目前，由于土地资源限制和枯萎病病原菌的顽固性，轮作和化学防治效果不佳，且存在环境污染和食品安全等问题，因此，嫁接是西瓜生产中用以克服连作障碍和枯萎病的有效手段。

南瓜是人类最早栽培的古老作物之一，它种类繁多，变异丰富，不仅是人类餐桌上的保健彩色蔬菜，也是瓜类生产克服连作障碍的重要砧木资源。生产上常见的南瓜种主要包括中国南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(Cucurbita maxima)和美洲南瓜(Cucurbita pepo)等种类。这些南瓜种起源不同，生态适应性也不同。印度南瓜起源于美洲秘鲁南部、玻利维亚和阿根廷北部的干燥地带，高温条件下，病毒病和白粉病发病严重。中国南瓜起源于墨西哥和中南美洲，在中国栽培历史悠久，普遍表现耐热、耐贫瘠、抗病，适应性广。通过种间远缘杂交，能够聚合不同亲本的优点，形成新的表型变异，为砧木育种提供丰富的种质资源。‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’是宁波市农业科学研究院重点针对西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种。该系列兼具中国南瓜的抗性和印度南瓜的嫁接亲和性，对西瓜品质无不良影响，深受瓜农欢迎。

随着甬砧系列印中杂交南瓜砧木品种的推广，鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。然而，目前砧木品种的鉴定多运用植株形态学鉴定等常规方法。这些方法耗时长、易受环境影响、可靠性差，面对品种繁多、外观表型相似的印中杂交南瓜砧木材料，鉴定真伪难以奏效。

砧木新品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’至今只作了大田形态学纯度鉴定，尚缺乏便捷有效的品种真实性鉴定方法，对于品种保护还远远不够。

三、发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种利用DNA指纹图谱鉴定甬砧系列印中杂交南瓜砧木品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’品种真实性的方法。

为实现本发明的目的，发明者提供以下技术方案：采用CTAB法提取‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照品种的幼叶DNA；利用5对SSR引物进行PCR扩增(引物名称与序列表中序列号的对应关系如表1所示，引物具体序列见本说明书最后所附序列表)；扩增产物经高分辨率琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。有差异的等位位点，扩增出条带的记为“1”，同一位置无带记为“0”；将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串，即构成DNA指纹图谱，用以区分3份印中杂交南瓜砧木品种及其对照。

本发明的优点：与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。

四、附图说明

图1为本发明实施例中，SSR引物N11/12、N41/42、N51/52、N121/122和N155/156‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增。

图1中左侧三幅图片自上而下分别是SSR引物N11/12、N41/42和N51/52在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增；右侧两幅图片自上而下分别是SSR引物N121/122和N155/156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增。两组图片样品排列顺序自左至右依次为DNA Marker、‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’、5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’。图片左侧标注是DNAmarker标准分子量，右侧标注是引物名称及差异位点所在片段大小。

五、具体实施方式

1、取样：播种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照，待植株长至5-6片真叶时，采集嫩叶1g，-80℃保存。