[发明专利]用于植物多基因表达载体构建的质粒体系及其应用

摘要

本发明公开了一种用于植物多基因表达载体构建的质粒体系及其应用。通过对大肠杆菌质粒载体pUC18和双核农杆菌Ti质粒pBI121进行改造，形成了重组质粒pKAFCR0和pKAFCR100。pKAFCR0具有植物基因表达最常用的35S启动子和NOS终止子，并在其上游、中间和下游引入了多个克隆酶切位点，利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可以多种方式连接到pKAFCR0的35S与NOS中间；pKAFCR100具有卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，以及其中间的多克隆酶切位点。pKAFCR0与pKAFCR100两个质粒的配套使用，可以方便地构建植物单个或多个基因表达载体。

主权项

1.用于植物多基因表达载体构建的质粒体系，其特征在于，包括pKAFCR0质粒和pKAFCR100质粒；/n所述pKAFCR0质粒通过以下步骤构建：/nS11、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对大肠杆菌质粒载体pUC18 DNA进行双酶切处理；/nS12、同样利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121 DNA进行双酶切处理；/nS13、将双酶切后的pUC18，以及同样双酶切后的pBI121，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段；/nS14、利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；/nS15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；/nS16、将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR1，即在pUC18的Hind III和EcoR I位点上，插入35S-GUS-NOS片段；/nS17、利用限制性内切酶Sma I和Sac I，对重组质粒pKAFCR1 DNA进行双酶切处理；/nS18、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除GUS报告基因片段的pKAFCR1；/nS19、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Sma I、Kpn I、Xho I和Sac I位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与切除GUS报告基因的pKAFCR1进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR2，即去除了pKAFCR1的GUS报告基因，并在此位置上增加了Kpn I和Xho I酶切位点；/nS120、利用限制性内切酶Hind III和Pst I，对重组质粒pKAFCR2 DNA进行双酶切处理；/nS121、将双酶切后的pKAFCR2经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已酶切的pKAFCR2。/nS122、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Hind III、Hpa I、Stu I、Sph I、PstI和Sbf I位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与已酶切的pKAFCR2进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR0，即在35S上游增加了Hpa I、Stu I和Sph I酶切位点；pKAFCR0在35S上游，35S与NOS中间以及在NOS下游均具有多克隆酶切位点；/n所述pKAFCR100质粒通过以下步骤构建：/nS21、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121 DNA进行双酶切处理；/nS22、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBsGFPDNA进行双酶切处理；/nS23、将双酶切后的pBI121，以及同样双酶切后的pBsGFP，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除35S-GUS-NOS片段的pBI121，以及从pBsGFP切取的35SΩ-sGFP-NOS片段；/nS24、利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将已切除35S-GUS-NOS片段的pBI121和从pBsGFP切取的35SΩ-sGFP-NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经50mg/L卡那霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR31，即将pBI121的35S-GUS置换成35SΩ-sGFP；/nS25、利用限制性内切酶Hind III和Pst I，对重组质粒pKAFCR31 DNA进行双酶切处理；/nS26、将双酶切后的质粒pKAFCR31，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已酶切的pKAFCR31；/nS27、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Hind III、Hpa I、Stu I、Sph I和SbfI位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将该DNA片段与已酶切的pKAFCR31进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经50mg/L卡那霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR100，即在35SΩ启动子上游增加了Hpa I、Stu I和Sph I酶切位点；pKAFCR100具有独立表达的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，以及其中间的多克隆酶切位点；/n所述的用于植物基因表达载体构建的质粒体系的应用，用于植物单个或多个基因表达载体的构建，以及利用该基因表达载体进行基因转化的转基因植物细胞或植物体。/n