[发明专利]一种水稻稻曲病抗性检测方法

摘要

本发明公开一种水稻稻曲病抗性检测方法，本发明选育水稻稻曲病抗性品种杂交种F1，并对杂交种F1通过分子标记得到抗水稻稻曲病的基因位点，并确定水稻稻曲病在第11号染色体上的位置。本发明涉及的水稻稻曲病抗性检测方法，通过检测水稻品种第11号染色体上引物标记的带型数据，评估其对水稻稻曲病的抗性，大大提高抗稻曲病水稻的选择效率。

主权项

1.一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于：其步骤如下：(1)杂交种F1的获得：以水稻稻曲病抗源湘优66为母本，水稻稻曲病高感品种红莲优6号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将湘优66植株的稻穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将湘优66植株的稻穗套好并作标记，待用；当红莲优6号植株进入开花期时，将红莲优6号植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中湘优66植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1；(2)杂交种F1的花药愈伤诱导：杂交种F1正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；剪去l/3颖壳及未开颖的小花，在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻稻曲病抗性品种；所述第一培养基的成分为：N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L；激动素KT2.0mg/L，山梨醇25g/L，2‑氨基‑5‑羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱0.3mg/L；pH值为6.0；所述第二培养基的成分为：MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B10.4mg/L，维生素B60.5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA0.5mg/L，生物素0.1mg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L；以及浓度20％的水稻稻曲病菌粗毒素提取液，pH值为6.0；(3)预处理：取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2％的β‑巯基乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基)氨基甲烷Tris‑HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体积百分比为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，混合均匀，将混合物加热到50～60℃并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50～80min，将混合物离心分散15～30min，提取上清液，在‑20℃环境中沉淀120～480min，离心分散后弃上清液得到DNA沉淀物；所述水稻叶片与β‑巯基乙醇、Tris‑HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/μL/μL/μL/μL为1:1～5:1～5:3～8:8～12；所述两次离心分散的速率为800～1600rpm；(4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物，所述296对SSR引物含54对自行合成引物；(5)PCR反应：PCR反应体系为：总体积为10μL，0.5μL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，1.2μL10×PCR buffer，上下游引物各1.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，补水至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后得到的PCR扩增产物4℃保存1h；(6)染色：向PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液，混合均匀后加入10％的聚丙烯酰胺PAGE的点样孔，恒压180V电泳2～3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下染色；(7)检测：根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析；检测水稻稻曲病的抗性数量性状基因座QTL，LOD值的阈值定为2.5～3.0，按P＝0.005的概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；(8)用第11号染色体分子标记RM4504引物：用分子标记RM4504引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2能够扩增出127bp的扩增片段，或用分子标记RM3133引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4能够扩增出98bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在抗水稻稻曲病位点，通过检测第11号染色体上所述两个引物标记的带型数据，评估该植株对水稻稻曲病的抗性。